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背景结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染所致的全球性传染病。当结核分枝杆菌进入人体后主要侵害宿主的巨噬细胞,巨噬细胞不仅具有吞噬和抗原递呈的功能,还可以分泌各种细胞因子等来介导炎性反应及调节免疫应答。此外,巨噬细胞在不同环境因素刺激下还可表现出极化现象,常见的的极化类型分为经典激活巨噬细胞（Ml型）和替代激活巨噬细胞（M2型）,这两种极化类型之间相互联系又相互拮抗,从而发挥不同的功能和作用。M1型巨噬细胞主要通过促炎因子的释放等来促进炎症反应并达到杀伤病原体的作用。M2型巨噬细胞则可通过抑制促炎因子的分泌等来发挥对抗炎症反应、促进血管的形成、基质重塑及组织纤维化等作用[1]。巨噬细胞的这种极化过程可受到多因子多通路的共同调控,目前的研究普遍认为JAK/STAT信号通路、JNK信号通路、PI3K/Akt信号通路和Notch信号通路可能参与到巨噬细胞极化过程中。在结核病中,目前较多的研究认为在结核杆菌感染早期及活动期结核患者的巨噬细胞以M1型为主,而在结核慢性感染过程中以M2型为主[2]。ESAT-6和CFP-10是结核分枝杆菌分泌的两种小分子蛋白,它们可作为主要的抗原肽刺激患者的外周血中释放IFN-γ,从而用于诊断感染结核分枝杆菌的患者[3]。E6、E7和C14是本实验室中从ESAT-6和CFP-10蛋白中筛选出的多肽片段,这三种多肽的分子量相较于ESAT-6和CFP-10更小,其针对结核的免疫反应的特异性或许更强。实验室的前期研究发现,结核特异性多肽E6、E7和C14可影响巨噬细胞的极化状态[4],但尚未对其诱导巨噬细胞分化的相关机制（即信号通路）进一步研究和探讨。实验目的1.探究结核特异性多肽对巨噬细胞极化分型及细胞因子表达的影响。2.初步探讨结核特异性多肽E7在诱导巨噬细胞极化方向上可能涉及的信号通路。第一部分结核特异性多肽对巨噬细胞极化的影响一、实验方法1.对THP-1细胞进行复苏和培养,用PMA刺激细胞贴壁生长。2.将贴壁的单核-巨噬细胞分为空白对照组、M1阳性刺激组、M2阳性刺激组、E6、E7和C14多肽刺激组,各组加入相应的刺激剂,细胞培养12h、18h、24h、36h和48h收集细胞。3.提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测M1型标志物（CD16、IL-6和TNF-α）和M2型标志物（CD163、CD206和IL-10）的表达情况。二、实验结果1.结核特异性多肽E6主要刺激单核-巨噬细胞分泌M2型标志物/细胞因子,主要表现为细胞因子IL-10的升高。2.结核特异性多肽C14刺激单核-巨噬细胞分泌M2型标志物/细胞因子,主要表现为CD163表面标志物的表达升高。3.结核特异性多肽E7刺激单核-巨噬细胞后M1型和M2型标志物/细胞因子均有升高,其中,M1型标志物中TNF-α在18h表达最高,M2型标志物中CD163在刺激24h后的表达量至高峰。第二部分结核特异性多肽E7诱导巨噬细胞极化信号通路的初步探讨一、实验方法1.对THP-1细胞进行复苏和培养,PMA刺激细胞贴壁生长。2.胸水分离单个核细胞后用磁珠分选方法分选出CD14+细胞,培养并刺激细胞贴壁生长。3.将贴壁生长的THP-1/胸水单核-巨噬细胞分为空白对照组、M1阳性刺激组和多肽刺激组（以结核特异性多肽E7为代表）,分别加入NF-kB阻断剂（PDTC）和JNK阻断剂（SP600125）进行刺激,用Western blot方法检测NF-kB p65、p-NF-kB p65和p-JNK蛋白的表达,同时用RT-PCR方法检测TNF-α的表达变化。4.将贴壁生长的THP-1/胸水单核-巨噬细胞分为空白对照组、M2阳性刺激组和多肽刺激组（以结核特异性多肽E7为代表）,分别加入PPARγ阻断剂（T0070907）进行刺激,用Western blot方法检测PPARγ蛋白的表达,同时用RT-PCR方法检测CD163的表达变化。5.用SPSS16.0软件进行统计学分析;用GraphPad Prism5软件进行作图。二、实验结果1.阻断NF-kB信号通路对结核特异性多肽E7刺激THP-1/胸水单核-巨噬细胞向M1型分化无明显影响;2.阻断JNK信号通路可影响结核特异性多肽E7刺激THP-1/胸水单核-巨噬细胞向M1型分化。即:结核特异性多肽E7刺激巨噬细胞分化为M1型过程中可能涉及JNK信号通路。3.阻断PPARγ信号通路可影响结核特异性多肽E7刺激THP-1/胸水单核-巨噬细胞向M2型分化。即:结核特异性多肽E7刺激巨噬细胞分化为M2型过程中可能涉及JAK-STAT信号通路。实验结论1.结核特异性多肽E6主要刺激单核-巨噬细胞向M2型分化,并以IL-10的升高为主。2.结核特异性多肽C14主要刺激单核-巨噬细胞向M2型分化,并以CD163的升高为主。3.结核特异性多肽E7在刺激单核-巨噬细胞分化时,前期以高表达TNF-α为代表的M1型为主,后期以高表达CD163为代表的M2型为主。4.结核特异性多肽E7刺激单核-巨噬细胞向M1型分化时以TNF-α升高为主,该过程所涉及的信号通路以JNK为主。5.结核特异性多肽E7刺激单核-巨噬细胞向M2型分化时以CD163升高为主,该过程所涉及的信号通路以JAK-STAT为主。