论文部分内容阅读
对本实验室鉴定的鸭瘟病毒UL47基因(GenBank NO.EU195109)进行生物信息学分析。针对UL47全基因和UL47基因主要抗原域分别设计并合成特异性引物,进行PCR扩增及序列测定。原核表达并制备了UL47基因主要抗原域(UL47基因ORF的1417-2353bp)蛋白的多克隆抗体,对UL47进行了转录时相研究,获得如下结果：DPV UL47基因的ORF为2367bp,由788个氨基酸组成,分子量约为87.95kDa,等电点为6.23,亲水、疏水氨基酸分别为227个和242个,各占28.8%和30.7%,酸性、碱性氨基酸分别为106个和121个,各占13.5%和15.3%。疏水性预测表明UL47蛋白疏水性最大值为2.6,最小值约为-3.8,疏水区主要位于369-370,393-406,490-493,510-516,526-528,622-630和641-648位氨基酸,亲水区在多肽链占据的位置明显大于疏水区。该多肽有73个潜在的磷酸化位点和3个N-糖基化位点,但无信号肽和跨膜区。亚细胞定位分析表明,UL47蛋白有69.6%分布于细胞核,13%分布于细胞膜,还有少量分布于线粒体、细胞浆和囊泡分泌系统中。二级结构预测结果显示该蛋白以a-螺旋为主(40.36%),β-转角和无规则卷曲的含量较少,都为11.93%。利用EMBOSS的CHIPS和CUSP程序分析DPV UL47基因密码子,结果表明其CAI、ENC值分别为0.71和52.40。由六种密码子编码的Arg,Ser和Leu,分别偏爱AGA,TCT和CTC,其Frequency(1/1000)高达24.081-31.686‰,而TCA、CTA的使用频率为零。Val偏爱GTC,Ile偏爱ATC,Phe偏爱TTC,His偏爱CAT,Gln偏爱CAA,三个终止密码子出现的频率较高。DPV UL47基因整体密码子的使用情况与其他(大肠杆菌、酵母和人)的差值较小,不具有明显偏差。另外,DPV UL47 G+C含量为44.99%,而第三位密码子的G+C含量(即GC3s)就达51.58%,表明UL47在第三位密码子上偏爱使用G或C。稀有密码子分析表明DPV UL47基因有72个稀有密码子,占总密码子的3.04%,其中21个AGA,13个AGG和6个CGA为精氨酸稀有密码子,12个CTA为亮氨酸稀有密码子,6个ATA为异亮氨酸稀有密码子,4个CCC为脯氨酸稀有密码子。系统发生树分析表明DPV UL47更接近a疱疹病毒UL47基因,并且与GaHV-2, GaHV-3, MeHV-1和MDV-2等禽类疱疹病毒的进化关系最近,以上分析结果为开展UL47基因功能研究具有一定的参考作用。通过对UL47全基因和UL47基因主要抗原域分别设计引物,进行PCR扩增及构建T克隆和亚克隆重组质粒,通过BamHⅠ单酶切、BamHⅠ/XholⅠ双酶切、质粒PCR及测序鉴定,成功将全基因及主要抗原域片段分别定向插入载体中,构建了T克隆及亚克隆重组质粒。IPTG诱导BL21进行表达。结果表明,UL47全基因未能表达,而UL47主要抗原域成功表达,蛋白大小为55kDa,符合理论值。表达形式分析表明UL47融合蛋白为包涵体,大量存在于超声破碎后的沉淀中。经过一系列表达条件优化表明37℃下,加入0.2 mmol/L的IPTG诱导6h,UL47主要抗原域蛋白表达量最大。利用纯化后的UL47主要抗原域蛋白制备兔抗UL47多克隆抗体,琼扩效价为1：16。免疫印迹结果显示UL47主要抗原域蛋白能与兔抗DPV抗体和兔抗UL47抗体相互作用,表明该蛋白具有免疫原性。此外,根据UL47基因一段核苷酸片段设计5’端以地高辛标记的寡核苷酸探针,然后应用该探针对GPV、DHV、PRV、MDV、MDPV、ILTV、DPV以及UL47基因T克隆质粒进行检测,同时设置未接毒的DEF核酸提取物为阴性对照,与实验组平行操作。试验结果为UL47基因T克隆重组质粒和DPV DNA显示紫褐色,其余均不显色,表明UL47基因确为DPV CHv UL47基因。根据内参基因β-actin和鸭瘟病毒UL47基因的保守序列分别设计了荧光定量引物,收集感染鸭瘟病毒后1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16 h、20 h、24h、30 h、36h、48h、54h、60 h、72h等不同时间段的鸭胚成纤维细胞,采用Trizol法提取细胞总RNA,然后进行逆转录,以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。试验结果显示感染鸭瘟病毒后的8h以内,UL47基因一直处于低转录水平,24h后转录产物量出现较迅速增加,36h达到峰值,随后产物量有所下降,但仍持续到感染后72h。