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烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)是RNA病毒的一种,主要侵染烟草及其他茄科植物,在寄主体内完全寄生性生存,侵染植物危害严重,尤其是严重威胁栽培作物的产量和质量。番茄病毒病害在番茄生产栽培中危害较大,在我国大部分番茄栽培区内普遍发生。烟草花叶病毒就是其主要病毒病原这一。生产中普遍采用的防治手段是选育抗病品种,常规的杂交育种培育抗病品种存在一定的局限性,而RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术作为一种分子生物学手段为植物病毒病害防治开辟了一条新途径。基于RNAi机制,以TMV复制酶基因(TMV-replicase,TMV-r)为RNAi的靶向基因,在NCBI网站对靶向基因进行序列同源性比对,确定RNAi的靶标序列,设计上下游引物,经RT-PCR从感染TMV病毒的烟草叶片中克隆靶向基因的靶序列片段。借助限制性内切酶将靶序列正向、反向构建到含35S超强启动子的RNAi表达载体相应克隆位点,特异引物PCR反应及酶切反应检测载体构建结构正确。经冻融法将表达载体重组质粒导入根癌农杆菌感受态细胞中,完成双元载体系统的构建。经叶盘法侵染番茄无菌苗,结合组织培养及激素诱导,通过抗生素选择性培养基筛选出9株番茄转化苗,继续培育后经特异引物PCR和NOS终止子引物PCR检测,确定3株为RNAi转基因番茄苗。对转基因番茄人工接种TMV病毒并调查感病进展。结果表明:与非转基因对照番茄相比,转基因番茄对TMV的抗病能力显著提高,两株达到显著抗病水平。选取表现抗病毒能力的转基因番茄苗2株,普通对照番茄4株,对样品番茄的总RNA进行荧光定量PCR检测,分析番茄接种TMV病毒后的体内病毒复制酶基因m RNA表达丰度。结果表明:人工接种TMV病毒后,转基因番茄体内TMV病毒复制酶基因的表达量明显低于其它对照品种,其中达高度抗病水平的转基因番茄中病毒复制酶基因的m RNA表达几乎为零。说明RNAi转基因番茄对TMV的抗性能力源于靶向基因的m RNA降解。