【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次被发现,临床主要表现为怀孕母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病。病原PRRS
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次被发现,临床主要表现为怀孕母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病。病原PRRSV属尼多病毒目动脉炎病毒科,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒.PRRSV基因组大小约为15kb,含有9个开放阅读框(ORFs),其中ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)作为病毒粒子中含量最高、免疫原性最强的结构蛋白之一,对于PRRS的诊断及监控防治具有重要意义。本研究选取欧洲型PRRSV SS-6毒株为研究对象,在克隆并鉴定该病毒N蛋白基因的基础上,进行N蛋白的原核表达,并利用表达的重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,为建立有效的欧洲型PRRSV检测方法以及N蛋白结构和功能研究奠定基础。1.欧洲型PRRSV N蛋白基因的克隆及原核表达根据GenBank中欧洲型PRRSV标准毒株(LV)ORF7基因序列设计了3条引物,且在其中两条引物上分别设计了EcoRI和XhoI酶切位点,以此引物扩增PRRSV SS-6毒株的N蛋白基因。将获得的PCR产物用EcoR I和Xho I酶切后与经同样处理的pGEX-6p-1原核表达载体进行连接,转化DH5α细胞后挑取阳性克隆。经酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒pGEX-N转化至E. coli BL-21中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,重组N蛋白分子量大小约为40kDa。免疫印迹试验结果显示,以融合表达的重组N蛋白免疫小鼠制备的抗血清能够与超速离心纯化的欧洲型PRRSV发生特异性反应,证明所表达的蛋白具有PRRSV抗原性.2.欧洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备取纯化的重组GST-N蛋白免疫6～8周龄Balb／c小鼠,分离其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,经过3次亚克隆获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为1B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgGl型,其轻链为κ链；间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应；ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：640,腹水的效价为1：256000。本研究为欧洲型PRRSV N蛋白结构和功能研究提供了有用工具。
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