【摘 要】
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Grb-AST是从蟋蟀(Gryllus bimaculatus)脑中分离的一种保幼激素抑制素,体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素.蟋蟀AST基因前体共编码15个AST多肽,Grb-ast是编码第2个多肽的序列,这个多肽含有8个氨基酸残基,一级结构为N-LPVYNFGL,所以定名为Grb-ast.根据Grb-ast和GKR(AST神经肽之间的连接序列)的编码序列设计合成两对引物.利用改进的
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Grb-AST是从蟋蟀(Gryllus bimaculatus)脑中分离的一种保幼激素抑制素,体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素.蟋蟀AST基因前体共编码15个AST多肽,Grb-ast<,2>是编码第2个多肽的序列,这个多肽含有8个氨基酸残基,一级结构为N-LPVYNFGL,所以定名为Grb-ast<,2>.根据Grb-ast<,2>和GKR(AST神经肽之间的连接序列)的编码序列设计合成两对引物.利用改进的"自身模板引物"法进行串联体的构建.先用T4 DNA polymerase构建成模板,再通过高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNA polymerase)PCR进行扩增,从中得到一个含有17个拷贝的Grb-ast<,2>的串联体基因.将Grb-ast<,2>串联体基因克隆进大肠杆菌pET-44a表达载体,将重组子导入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)进行表达,菌液浓度(OD<,600=0.8>)、诱导剂(IPTG)浓度1.0mM、37℃组合进行诱导表达5小时,表达量最高.Uvi光密度扫描分析表明Grb-ast<,2>基因表达量占细菌总蛋白的37.2﹪.表达产物经QIAGEN公司的Ti-NTA Agarose试剂盒纯化目的蛋白后,进行虫效研究,初步实验结果显示对甜菜夜蛾幼虫具有一定的毒杀作用及抑制生长发育.
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