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目的:钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体引起的世界范围内广泛流行的人兽共患性传染病。目前所用的商品化疫苗只能产生短期免疫效果,且缺乏不同血清型间的交叉保护作用。钩端螺旋体外膜蛋白在疾病感染中发挥重要作用,并具有属特异性,成为目前钩体疫苗开发的热点。本实验运用逆向疫苗学的理论和方法对钩体部分疫苗候选基因进行分析及免疫学特征检测,旨在筛选出高效、广谱的钩体疫苗候选基因。方法:本实验首先从已预测出的钩体疫苗候选基因挑取8个基因,进行生物学特征分析。并对这8个基因进行克隆、表达、纯化并制备多克隆抗体。通过ELISA及Western blot方法检测钩体疫苗候选基因编码蛋白与感染钩体动物血清的反应性;流式细胞术检测其在钩体细胞中的定位;以及Western blot检测外膜蛋白在我国15株致病性问号钩体及1株非致病钩体中的表达情况。从而筛选出更高效、广谱的钩体疫苗候选者。此外,从筛选出的蛋白中选取LA3469编码的铁离子调节蛋白A,经生物信息学预测其生物特征,并通过体外黏附抑制实验及杀菌实验检测该蛋白所产生抗体的免疫保护性,进而通过改变环境中铁离子浓度及检测钩体感染动物体内铁离子浓度的变化,研究钩体的生长及致病性与铁离子调节的关系。结果:通过对这8个钩体疫苗候选基因的信号肽,跨膜结构及结构域分析,推测这8个蛋白可能均位于外膜,均含有较多的T、B细胞抗原表位,因此可能会刺激机体产生较强的免疫反应。成功构建这8个钩体疫苗候选基因的原核表达重组体,并成功表达,纯化其中7个并制备多克隆抗体,这7个基因分别为LA0272、LA0301、LA0365、LA1404、LA1495、LA3469及LB061。进而对这7个基因所编码蛋白的免疫学特征进行检测。实验表明这7个钩体外膜蛋白均具有较强的免疫原性及与钩端螺旋体赖株兔血清的免疫反应性;流式细胞术检测未知蛋白的细胞定位,分析筛选出4个位于外膜的蛋白基因:LA0301、LA1495、LA3469和LB061。保守性分析显示:LA0301、LA3469和LB061编码蛋白在钩体赖型致病株及非致株中均表达,而LA1495和LA1404在致病株中表达,而非致病株中不表达。综合以上结果筛选出4个新的未知功能基因(LA0301、LA1495、LA3469和LB061)作为钩体疫苗候选基因。此外,LA3469是由COG注释的铁离子调节蛋白A基因,通过生物信息学分析预测在LA3468～LA3471区可能存在一个铁离子调节域。并实验证明钩体在体外生长及体内感染过程中均与铁离子调节有关,因此LA3469编码的蛋白可能是与钩体致病性相关的蛋白。钩体黏附抑制实验及杀菌实验表明LA3469编码蛋白的抗体在体外具有良好的免疫保护性。因此,LA3469可能是良好的疫苗候选基因。结论:(1)本实验运用逆向疫苗学的方法筛选到4个新的未知功能基因(LA0301、LA1495、LA3469和LB061)作为钩体疫苗候选基因。为进一步大规模筛选和鉴定疫苗候选基因构建了实验平台。(2)本实验首次通过流式细胞术鉴定钩体外膜蛋白的细胞定位,为大规模筛选鉴定钩体新的外膜蛋白质奠定了基础。(3)通过对钩体疫苗候选基因LA3469进一步研究,表明钩体的生长与致病性可能与铁离子调节有关,LA3469编码的铁离子调节蛋白A可能是与钩体致病性相关的蛋白,其抗体具有体外免疫保护性。因此,LA3469可能是有效的钩体疫苗候选基因。