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甘蓝(Brassica oleracea L.)是十字花科芸薹属的二年生蔬菜作物,是我国重要的秋冬季蔬菜作物之一。目前,在甘蓝类蔬菜雄性不育杂交育种中,几乎完全使用单一的ogura CMS细胞质不育资源,该现状形成了甘蓝类蔬菜胞质成分的遗传脆弱性,存在较大的遗传风险。另外,针对甘蓝类蔬菜ogura CMS细胞质不育利用基因工程或远缘杂交方式已获得恢复系,导致基于ogura CMS细胞质不育的种质资源技术保护被打破,优异种质资源流失的可能性加大。因此,针对上述问题,有必要挖掘或创制新的甘蓝类蔬菜CMS细胞质雄性不育资源投入甘蓝杂种优势育种。另外,在甘蓝类蔬菜生产中,霜霉病、软腐病、菌核病、灰霉病等病害时有发生。加上植株叶片的衰老使上述病害的发生以及危害程度被进一步加剧。因此,针对甘蓝抗病防御系统以及衰老相关基因进行协同改良,有望实现甘蓝对多种病害的水平抗性。自然存在的细胞质雄性不育性状大多是由于线粒体基因组异常造成的。MSH1基因是维持线粒体基因组稳定性的重要基因,在拟南芥、烟草和番茄中均报道了该基因的缺失使植物线粒体基因组紊乱而出现雄性不育现象。DMR6(霜霉病抗性6)基因属于病原体易感性相关基因,其编码的蛋白参与了病原体-植物相容机制,对植物的病原体防御起负作用,在拟南芥和番茄中报道了DMR6的缺失赋予植物对多种病原体的水平抗性。SGR/HG基因作为调控叶绿素降解过程的相关基因,其编码的脱镁螯合酶可从游离叶绿素和叶绿素复合物中提取镁,参与叶绿素降解过程。水稻和白菜中发现SGR基因的缺陷,使得植物叶绿素分解途径受阻,导致植物出现滞绿、耐衰老表型。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过sgRNA引导Cas9蛋白对基因组的靶位点进行准确切割并激活NHEJ修复途径,造成靶位点碱基的缺失、替换和插入,成为目前创制农作物突变体的理想工具,但是该系统无法实现目标基因的精确编辑。在CRISPR/Cas9技术的基础上发展而来的单碱基编辑技术,利用脱氨酶活性可在基因组的指定位置上进行精确的单个碱基的替换。VQR-BE3是在BE3的基础上用VQR代替原SpCas9形成的单碱基编辑系统,PAM识别序列为NGA,可以将编辑窗口中的碱基C替换为碱基T。该系统对于拓宽植物基因编辑的范围,实现多性状的堆叠具有重要的价值。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除与线粒体基因稳定性相关的基因BoMSH1和自交不亲和关键基因BoSRK;建立基于表型辅助筛选的CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对甘蓝抗病相关基因BoDMR6以及叶片滞绿基因BoHG进行敲除,获得相应的甘蓝突变材料。另外,同时直接将一个在人类细胞中成功实现碱基编辑的VQR-BE3碱基编辑器应用于模式植物烟草,检测其在缺少植物密码子优化的情况下的单碱基编辑效率,为能否将该单碱基编辑器直接应用于后续的甘蓝基因突变奠定基础。本实验结果如下:1.构建甘蓝BoMSH1、Bo SRK基因的CRISPR/Cas9双敲除载体pCas-tBoMSH1-ABCD/tBoSRK-ABCD,通过农杆菌介导的侵染法转化甘蓝自交不亲和系F416,获得转基因植株34株。经突变分析发现,BoMSH1基因的突变频率是2.94%,而BoSRK基因的突变频率为81.82%,双基因的突变频率为2.41%。本试验仅获得1株msh/srk双突变体,通过单克隆测序发现该植株的BoMSH1基因和BoSRK基因均为杂合突变,而仅有srk突变体中有4株为纯合突变。与野生型F416对照株相比,msh1/srk突变植株的叶边缘呈锯齿状。花粉活力检测结果显示,msh1/srk突变植株的花粉活力与野生型基本相同。msh1/srk突变植株蕾期和花期自交形成的种荚在初期可以正常的伸长生长,但后期干瘪不膨大,内部胚胎不发育,无法获得后代种子,其原因有待于进一步研究。2.构建BoDMR6、BoHG基因的甘蓝敲除载体pCas-MC-tBoDMR6-ABC/tBoHG-ABCD,MYB和mCherry基因为表型辅助筛选基因。通过农杆菌介导的侵染法转化自交不亲和的甘蓝F416,获得12株具有紫红色表型的甘蓝转基因幼苗。经突变分析发现,BoDMR6基因的突变频率是0%,而BoHG基因的突变频率为25%。仅获得3株甘hg突变体,其中1株为纯合突变,其余为杂合突变。3.构建烟草NtPDS基因的VQR-BE3单碱基编辑载体pCA-VQR-BE3-tNtPDS-ABCD,经农杆菌转化法获得41株转基因烟草。通过测序发现所有转基因烟草的NtPDS基因各靶位点均未发生单碱基C-T替换,碱基替换效率为0%。为简便转基因阳性植株的筛选,检测是否靶向位点影响VQR-BE3的碱基替换率,选取3个新的NtPDS基因靶向位点,构建了基于MYB色素基因辅助筛选的VQR-BE3单碱基编辑载体pCA-VQR-BE3-MYB-tNtPDS-EFG,经农杆菌侵染转化和标记基因辅助筛选获得23株呈紫红色的转基因烟草植株。经测序检测发现,23株转基因烟草中NtPDS基因各靶位点均未检测到相应的C-T替换,碱基替换效率仍为0%。推测本研究中所采用的VQR-BE3单碱基编辑系统未能成功实现烟草C-T碱基替换的原因可能与缺少植物密码子偏好性优化、在5’端缺少核定位信息等有关,详细的原因有待进一步研究。