论文部分内容阅读
肝纤维化(hepaticfibrosis)是多种致病因素引起慢性肝病，进一步发展为肝硬化的一个共同病理途径。细胞外间质(ECM)的过度合成与异常沉积是其主要病理改变，肝星状细胞(HSCs)在肝纤维化的形成过程中发挥关键作用。它在正常情况下主要储存维生素A，合成少量胶原，活化的HSCs转化为肌成纤维样细胞，其自身增殖和胶原合成增加。肝纤维化恢复期HSCs凋亡明显增多，HSCs的凋亡对于肝纤维化逆转起着关键作用。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是17年前发现的一种与细胞内信号传导有关的第二信使。它能磷酸化磷脂酰肌醇(PI)的第三位羟基生成磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。PI3K是由两部分组成的异源性二聚体，其中p85是调节亚单位，p110是催化亚单位。p85亚单位包含两个SH2功能域和一个SH3功能域。当细胞被生长因子刺激后，p85亚单位的SH2功能域与酪氨酸磷酸化受体结合，进而将p85·p110复合体结合于细胞膜内侧以转导信息。Akt又称蛋白激酶B(PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞内信号转导系统中位于PI3K的下游，1991年被发现，是癌基因v-akt编码产物的同系物。目前发现至少存在3种Akt家族成员：Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ、Akt3/PKBγ，这三种亚型在结构上具有高度的同源性，但在不同组织中的表达各不相同。其活化都依靠两个位点的磷酸化：一个是活性区，另一个是羧基端疏水区。不但包括胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)在内的各种生长因子可以使Akt活化，其他可以激活PI3K的细胞因子如整合素家族和G蛋白耦联受体家族也可以使之激活。Akt主要通过对含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促进细胞增殖的作用。
PDGF是HSCs最强有力的促有丝分裂因子。肝纤维化的发生伴有PDGF和其受体表达的增加。PDGF受体与其配体相结合后，细胞内酪氨酸酶的活化，其酪氨酸残基发生自身磷酸化。PDGF已被证实在包括HSCs在内的多种细胞中能够传递增殖信号。活化的PDGF受体与许多能够激活Ras的信号分子有很强的亲和力，从而可以进一步激活下游的Raf,MEK以及ERK。PI3K是一种能与活化的PDGF受体相结合的重要的信号转导分子。活化的PI3K生成几种磷酸肌醇，通过磷脂酰肌醇三磷酸依赖性激酶(PDK1)使Akt的Thr308和Ser473位点发生磷酸化而激活Akt。活化的Akt位于信号转导途径下游，可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。研究证实PDGF可以诱导HSCs内的PI3K和Akt发生磷酸化而活化，阻断PI3K后可以抑制HSCs的黏附和迁移作用；另外，PI3K的活化对于HSCs的Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达至关重要，阻断PI3K后显著抑制HSCs的Ⅰ型胶原蛋白表达，因此这条信号转导通路在HSCs的增殖和胶原合成中也起着关键作用。
迄今，关于PI3K/Akt信号转导通路与HSCs的凋亡之间的关系的研究甚少，为此，运用多种实验方法，对PI3K/Akt信号转导通路在HSCs凋亡中的作用做了初步研究。
目的：探讨PI3K/Akt信号转导途径在活化的肝星状细胞凋亡中的作用。
方法：应用体外HSCs培养技术，利用PDGF激活HSCs后，以一定浓度的LY294002阻断PI3K/Akt通路。采用免疫细胞化学方法检测HSCs中PI3K和p-Akt的表达，Westernblotting方法检测PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表达，RT-PCR法检测PI3K基因水平的表达；采用膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)联合标记流式细胞术测定HSCs凋亡率以及透射电镜观察HSCs凋亡。
结论：特异性地阻断PI3K/Akt通路能够诱导PDGF活化的HSCs发生凋亡。