论文部分内容阅读
近年来肺癌已经成为世界上发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。其中，非小细胞肺癌的发病率约占85％，临床检测发现时已处于中晚期，5年生存率约15.6%。化疗是治疗非小细胞肺癌的主要手段，肿瘤缓解率为40~50%。但是化疗极易产生耐药性，从而导致化疗失败。因此，肿瘤耐药性已经成为肿瘤临床治疗的一大难题。本课题拟寻找到与肿瘤耐药性相关的关键因子，探讨其耐药机制，研究克服肿瘤多药耐药性的方法，从而达到治疗肿瘤的目的。 Axl是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)家族的一员，它的配体Gas6，是由生长停滞特异性基因6（Growth arrest specific gene6，Gas6）所编码的蛋白分子。Axl与配体Gas6结合后能激活其自身的酪氨酸激酶活性，并激活下游信号转导通路，从而发挥其促生长、生存和增殖等作用。研究发现Axl的异常表达，参与肿瘤细胞的存活、增殖、凋亡等方面的调控，并与肿瘤细胞的恶性程度及耐药性密切相关。有研究发现通过使用Axl受体酪氨酸激酶抑制剂，能促使神经母细胞瘤细胞凋亡并增强癌细胞的化疗敏感性。 小干扰RNA又称沉默RNA，通常是一段由21-25个核苷酸组成的双链RNA，主要通过RNA干扰作用调节蛋白表达，RNA干扰现象是转录后水平的基因沉默，是指外源或者内源性的双链RNA可引起与该RNA同源的mRNA产生特异性的降解，阻断体内特定蛋白的表达，从而使细胞表现为相应基因缺失的表型。RNAi能够抑制转座子活性、抵御病毒入侵、参与异染色质的形成及维持并参与调控基因表达，参与调控机体的生长发育及代谢活动，具有重要的生物学意义，广泛应用于探索基因功能以及疾病的基因治疗领域。目前，RNA干扰技术已成为新型的基因疗法，通过高效特异性的阻断特定基因的表达，广泛应用于肿瘤的基因治疗领域，具有良好的治疗前景。 上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是指细胞在多种因素刺激下由上皮表型向间质表型转化的现象，参与调控胚胎发育中涉及的基因转录，炎症反应，组织再生，器官纤维化，肿瘤的侵袭和转移等过程。已有研究表明，EMT的表型状态与非小细胞肺癌细胞对表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）的敏感性密切相关。 本课题主要从事非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的耐药性及其机制研究，已有研究表明Axl的过表达与肿瘤细胞的恶性程度及转移性密切相关。但是Axl与非小细胞肺癌耐药的相关性及其机制尚不清楚。本课题拟采用RNA干扰技术，探讨Axl在肿瘤细胞A549和H460耐药性及EMT进程中的作用及其作用机制。现将研究结果归纳如下： 1.以人类EGFR野生型非小细胞肺癌细胞系H460和A549细胞为研究对象，通过RNA干扰作用使Axl基因沉默，Western Blot检测结果表明，Axl蛋白表达显著降低，质粒转染成功，为进一步实验打下基础； 2. MTT法检测细胞存活率结果表明，利用RNA干扰技术关闭Axl基因的表达，可促进肿瘤细胞的死亡，且具有时间依赖性，提示Axl与肿瘤的增殖有关；将Axl siRNA转染至非小细胞肺癌细胞A549细胞与H460细胞，均可降低阿霉素、长春新碱、紫杉醇三种药物的IC50，且差异具有统计学意义，提示Axl基因表达情况与NSCLC细胞耐药性密切相关，通过降低Axl基因的表达，能够提高NSCLC细胞的对化疗药的敏感性，降低细胞对化疗药的耐药性，为临床治疗非小细胞肺癌提供理论依据。通过将Axl siRNA转染至非小细胞细胞系A549细胞与H460细胞，能够提高siAxl A549细胞和siAxl H460细胞对厄洛替尼的敏感性，显著降低肿瘤细胞存活率。当厄洛替尼浓度为1-10μM时，抑制作用更为显著； 3.流式细胞术检测结果表明，利用RNA干扰技术关闭Axl基因的表达，可促进A549细胞与H460细胞凋亡，且具有剂量和时间依赖性，提示Axl与肿瘤细胞的凋亡有关； 4. Western Blotting检测结果表明，通过将Axl siRNA转染至非小细胞肺癌细胞系A549细胞与H460细胞，能够降低Axl的表达，并且降低磷酸化Akt及磷酸化ERK的表达，提示通过RNA干扰作用使得Axl基因沉默，从而抑制肿瘤细胞增殖，降低其存活率，提高对化疗药物阿霉素、长春新碱、紫杉醇及厄洛替尼的敏感性，这一作用可能是通过抑制PI3K/Akt及ERK的磷酸化来实现的。总之，通过RNA干扰抑制Axl的表达，能够抑制肿瘤细胞增殖，提高非小细胞肺癌对化疗药的敏感性，其作用机制是通过抑制Akt和ERK1/2的磷酸化实现的； 5.实时荧光定量RCR结果表明，将Axl siRNA转染至非小细胞肺癌细胞系A549细胞与H460细胞，上皮型标志蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin）mRNA转录水平提高,间质型标志蛋白N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）转录水平降低，提示Axl基因敲除能够抑制A549细胞和H460细胞的EMT进程。 综上所述，Axl基因的表达不仅与恶性肿瘤的增殖、凋亡、浸润和转移密切相关，而且影响肿瘤细胞的耐药性，这一作用机制可能是通过抑制PI3K/Akt通路和ERK通路的激活以及促进细胞发生EMT进程来实现的。