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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性自身免疫性疾病,可累及全身多个系统。狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)是SLE最常见的并发症,临床可表现为慢性肾炎综合征、肾病综合征甚至急进性肾炎,病理类型多样,病程呈慢性缓解和急性发作交替的特点,直接影响其预后。免疫炎症反应是LN进展的主要机制之一。
腺苷是在缺氧、缺血和炎症时由组织局部产生,传统作用是调节组织血流。大量研究表明,腺苷是一种重要的内源性抗炎和免疫抑制分子,其作用主要是通过与G蛋白偶联的腺苷受体(Adenosine receptors,ARs)介导。目前已发现腺苷受体有四种亚型,并已被成功克隆,分别为A1,A2A,A2B和A3腺苷受体。四种腺苷受体亚型均表达于免疫细胞表面,并参与先天性和获得性免疫系统的调节。最新研究表明激活A2A亚型腺苷受体(A2AR)能抑制炎症级联反应,包括减少中性粒细胞氧代谢产物的产生、抑制单个核细胞促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-12)的释放、抑制T细胞的活化和功能。
A2AR mRNA不仅表达于免疫细胞,还表达于正常大鼠肾脏固有细胞如肾乳头和外髓降小管直部。在链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠糖尿病肾病肾皮质中A2ARmRNA和蛋白表达增加。激活A2AR可减轻T细胞介导的小鼠肠炎,抑制促炎因子的表达,抑制MLR—T细胞增生和小鼠皮肤移植排斥反应,抑制新月体肾炎巨噬细胞的激活。然而,A2AR在LN中的作用尚不清楚。因此,本研究探讨:①A2AR在小鼠狼疮肾炎模型肾脏的表达；②选择性激活A2AR对小鼠狼疮肾炎模型蛋白尿、肾功能、肾脏病理损害及肾脏炎症细胞浸润的影响；③选择性激活A2AR对小鼠狼疮肾炎模型脾细胞增殖和活化的影响。
第一章MRL/lpr小鼠狼疮肾炎A2AR的表达
一、材料和方法
1.小鼠狼疮肾炎模型
MRL/lpr小鼠在12周龄时已有明显肾损害,取9只雌性MRL/lpr小鼠作为模型组,以8只12周龄雌性MRL/MP小鼠作为正常对照组。代谢笼留取24小时尿,测尿蛋白肌酐比值及24小时尿蛋白定量。麻醉后心脏穿刺取血分离血清检测血肌酐,血尿素氮及抗dsDNA抗体。留取肾脏、唾液腺、脾脏,同时称脾脏和淋巴结总重量。部分组织以10％中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,肾组织石蜡切片行常规病理染色和免疫组化染色。部分肾组织以OCT包埋,冰冻切片行免疫组化及免疫荧光检测,其余液氮冷冻,-80℃保存,用于RT-PCR、Western Blot检测。
2.细胞培养
大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E(n=3)及人肾小管上皮细胞株HK-2(n=3),用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养,培养条件为37℃,5％CO2的细胞培养箱,每2～3天换液一次。细胞融合约90％～100％时收集蛋白。
3.淋巴结及脾肿大的评价
处死动物后,称量每只动物淋巴结(颈部、支气管)及脾脏的重量,结果以均数±标准差表示。
4.组织学损伤评估
肾组织、唾液腺石蜡切片行HE、PAS染色,观察肾小球、肾小管、肾血管及唾液腺病理损害情况。肾小球损害程度按0-3分的半定量计分方法评价:正常肾小球,为0分；系膜细胞增殖和(或)细胞浸润,为轻度记为1分；系膜细胞增殖和(或)细胞浸润基础上伴系膜插入和(或)内皮细胞增生,为中度记为2分；中度损伤基础上伴有新月体形成为重度记为3分。每只动物至少评价40个连续非重叠的肾小球(×400),最终评分由所有高倍镜下肾小球计分的平均值得出。肾小管间质损伤定义为近端小管刷状缘消失、肾小管扩张、萎缩以及管型形成。肾小管损害程度按0-4分的半定量计分方法评价:正常肾小管,为0分；损害肾小管数占总肾小管数<25％,为1分；25％-50％,为2分；51％-75％,为3分；>75％,为4分。每只动物至少评价30个连续非重叠的高倍镜下视野(×400),最终评分由所有高倍镜下视野计分的平均值得出。肾血管损害程度按0—3分的半定量方法评价:正常血管,为0分:血管周围细胞浸润,为轻度记为1分；有动脉壁的破坏,为中度记为2分；有肌层和内膜的增厚,为重度记为3分。对每只动物的所有血管进行评价,最终评分由所有计分的平均值得出。颌下腺炎症程度按0-3分的半定量方法评价:正常,为0分；细胞浸润局限于血管和(或)导管周围,为轻度记为1分:腺体实质也有细胞浸润,为中度记为2分；有纤维化和(或)肉芽肿形成,为重度记为3分。对每只动物颌下腺的所有导管及血管进行评价,最终评分由所有导管及血管评分的平均值得出,结果以均数±标准误表示。
5.免疫组织化学及免疫荧光染色和量化
肾组织石蜡切片用大鼠抗.人CD3抗体(与小鼠T细胞有交叉反应,识别小鼠T细胞)和抗小鼠A2AR抗体行免疫组织化学染色。冰冻切片用大鼠抗-小鼠CD68抗体(识别小鼠巨噬细胞)免疫组化染色。分别计算20个连续非重叠肾小球、20个肾间质及5个血管周围高倍镜视野下(×400)CD68+巨噬细胞数和CD3+T细胞数。冰冻切片分别用FITC标记的抗小鼠IgG和抗小鼠C3抗体免疫荧光染色。IgG和C3免疫荧光染色按0-3分半定量评分进行评价:无沉积记为0分,轻度沉积记为1分,中度沉积记为2分,重度沉积记为3分。每只动物至少评价25个连续非重叠肾小球,结果以均数±标准误表示。
6.RT-PCR
提取肾组织总RNA,RT-PCR检测MHCⅡ、MCP—1、IFN-γ和A2AR mRNA,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。
7.Western Blot
提取肾组织及各肾小管上皮细胞株蛋白,Western Blot检测A2AR,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。
8.统计学分析
均数比较采用方差分析(ANOVA),p<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.蛋白尿
MRL/Ipr小鼠在12周龄开始出现蛋白尿,正常对照组只有少量尿蛋白排泄,模型组和正常对照组相比尿蛋白定量显著增多。24小时尿蛋白分别为(1.51±0.41)mg/24h vs(0.41±0.06)mg/24h；蛋白肌酐比分别为(5.62±0.7)mg/mg vs(0.27±0.04)mg/mg。P值均小于0.01。
2.血生化
MRL/Ipr狼疮小鼠模型血清尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)水平与正常对照组相比,均有显著升高。BUN分别为(8.19±0.58)mmol/L vs(5.86±0.47)mmol/L。Cr分别为(12.44±1.01)μmol/L vs(10.51±1.2)μmol/L。正常对照组未检测到抗dsDNA抗体。MRL/Ipr狼疮小鼠模型血清抗dsDNA抗体明显升高(53.34±21.2)μg/ml。p值均小于0.01。
3.脾脏和淋巴结重量
MRL/Ipr狼疮小鼠模型组脾脏和淋巴结增生肿大明显,其重量显著高于正常对照组,分别为(135.7±12.1)mg vs(91.0±13.0)mg和(89.3±17.8)mg vs(17.6±8.0)mg。p值均小于0.01。
4.肾脏组织学
MRL/Ipr狼疮小鼠模型的组织学改变包括肾小球细胞增生和(或)浸润、肾小管间质损伤、血管损伤及唾液腺炎症。模型组和正常对照组肾小球评分分别为(1.03±0.04)vs(0.01±0.003),肾小管间质评分分别为(0.14±0.02)vs(0.01±0.001),肾血管评分分别为(0.46±0.1)vs(0.003±0.006),唾液腺炎症评分分别为(0.46±0.06)vs(0.01±0.001)。p值均小于0.01。
5.肾脏炎症细胞浸润
免疫组化染色显示在正常对照组小鼠肾间质偶尔见个别巨噬细胞和T细胞浸润,肾小球内极少见巨噬细胞浸润,肾血管周围偶尔见个别巨噬细胞和T细胞浸润。而在小鼠狼疮肾炎模型中,肾间质内巨噬细胞和T细胞浸润明显增多,肾血管周围巨噬细胞和T细胞浸润显著增多,但肾小球内仅检测到少量巨噬细胞和T细胞。
模型组和正常对照组肾小球巨噬细胞浸润数分别为(0.6±0.04)细胞/gcs(肾小球横切面,gcs)vs(0.03±0.03)细胞/ges;肾小管间质为(8.4±0.26)细胞/hpfva(0.3±0.05)细胞/hpf;血管周围为(20.9±0.96)细胞/血管 vs(0.3±0.1)细胞/血管。p值均小于0.01。
模型组和正常对照组肾小球T细胞浸润数分别为(0.06±0.02)细胞/gcs vs(0.01±0.02)细胞/gcs；肾小管间质为(1.8±0.2)细胞/hpf vs(0.1±0.04)细胞/hpf;血管周围为(9.0±3.6)细胞/血管vs(0.24±0.07)细胞/血管。p值均小于0.01。
6.肾脏IgG和C3沉积
免疫荧光染色显示,小鼠狼疮肾炎模型肾组织中有大量的IgG和C3呈颗粒状沉积于肾小球毛细血管壁、系膜区；肾小管间质及小动脉壁也有不同程度沉积。模型组和正常对照组肾脏IgG荧光强度评分分别为(0.97±0.18)vs(0.01±0.02)；C3分别为(0.64±0.1)vs(0.01±0.01)。p值均小于0.01。
7.肾脏MHCⅡ、MCP-1和IFN-γ mRNA表达
RT-PCR结果显示,狼疮小鼠肾脏MHCⅡ、MCP-1和IFN-γmRNA表达与正常对照组相比明显增高,分别为(0.47±0.12)vs(0.05±0.02)；(0.23±0.05)vs(0.09±0.03)和(0.15±0.04)vs(0.02±0.01)。p值均小于0.01。
8.肾脏A2AR的表达
RT-PCR显示,狼疮肾炎小鼠肾脏A2AR mRNA的表达显著上调(0.45±0.28)vs(0.18±0.09)；Western blot结果显示,狼疮肾炎小鼠肾脏A2AR蛋白的表达显著上调(2.63±0.71)vs(0.50±0.18)。p值均小于0.01。免疫组化显示,正常对照组小鼠肾脏未检测到A2AR的表达,而狼疮肾炎小鼠A2AR染色阳性细胞主要位于肾小球上皮细胞、毛细血管袢、肾小管上皮细胞以及肾间质细胞中。
9.肾小管上皮细胞株A2AR的表达
Western blot结果显示,在HK-2及NRK-52E这两种肾小管上皮细胞株均表达A2AR蛋白
三、小结
1.MRL/lpr小鼠于12周龄出现肾脏损害,表现为蛋白尿、血肌酐升高,肾脏病理表现为肾小球细胞增生、免疫复合物沉积、肾间质损害和肾小血管炎；
2.MRL/lpr小鼠肾脏MHCⅡ、MCP-1和IFN-γ mRNA表达增加,伴有显著T细胞和巨噬细胞浸润；
3.MRL/lpr小鼠肾脏A2AR mRNA和蛋白质表达上调,A2AR表达于肾小球上皮细胞、毛细血管袢、肾小管上皮细胞以及肾间质细胞中。
4.肾小管上皮细胞株(HK-2及NRK-52E)表达A2AR蛋白。
第二章CGS21680对MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的影响
一、材料和方法
1.小鼠狼疮肾炎治疗
12周龄的雌性MRL/lpr小鼠共16只,分为治疗组和模型对照组,各8只小鼠。治疗组小鼠每日腹腔注射选择性A2AR激动剂CGS21680(0.4mg/kg/d),治疗8周,模型对照组仅给予等量溶媒腹腔注射。治疗过程中每2周用代谢笼留取24小时尿,测尿蛋白肌酐比值及24小时尿蛋白定量。20周时麻醉后心脏穿刺取血分离血清检测血肌酐,血尿素氮及抗dsDNA抗体。留取肾脏、唾液腺、脾脏,同时称脾脏和淋巴结总重量。部分组织以10％中性福尔马林溶液固定石蜡包埋,肾组织石蜡切片行常规病理染色和免疫组化染色。部分肾组织以OCT包埋,冰冻切片行免疫组化和免疫荧光检测,其余液氮冷冻,-80℃保存,用于RT-PCR、Western Blot检测。20周龄雌性MRL/MP小鼠作为正常对照组。
2.淋巴结病变及脾脏肿大的评价
处死动物后,称量每只动物淋巴结(颈部、支气管)及脾脏的重量,结果以均数±标准差表示。
3.组织学损伤评估
肾组织石蜡切片行HE、PAS染色,观察肾小球、肾小管、肾血管及唾液腺病理损害情况,具体评分方法同第一章。
4.免疫组织化学及免疫荧光染色和量化
肾组织石蜡切片用大鼠抗-人CD3抗体(与小鼠T细胞有交叉反应,识别小鼠T细胞),抗小鼠I-AK单克隆抗体(识别小鼠MHCⅡ阳性细胞。冰冻切片分别用大鼠抗.小鼠CD68抗体(识别小鼠巨噬细胞)免疫组化染色,FITC标记的抗小鼠IgG和抗小鼠C3抗体免疫荧光染色,具体评分方法同第一章。
5.RT-PCR
提取肾组织总RNA,RT-PCR检测MHCⅡ、MCP-1、IFN-γ和A2AR mRNA,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。
6.Western Blot
提取肾组织蛋白,Western Blot检测A2AR,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。
7.统计学分析
均数比较采用方差分析(ANOVA),p<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.CGS21680对狼疮小鼠蛋白尿的影响
CGS21680治疗8周后,治疗组尿蛋白显著低于模型对照组。20周时治疗组和模型对照组24小时尿蛋白分别为(1.76±0.32)mg/24h vs(2.79±0.53)mg/24h；尿蛋白肌酐比分别为(5.13±1.63)mg/mg vs(7.93±1.40)mg/mg。P值均小于0.05。
2.CGS21680对狼疮小鼠血生化的影响
CGS21680治疗8周后,治疗组小鼠肾功能显著改善。治疗组血尿素氮水平明显下降,治疗组和模型对照组分别为(9.4±0.3)mmol/L vs(12.7±2.6)mmol/L:血清肌酐水平亦明显下降,治疗组和模型对照组分别为(16.2±0.9)μmol/L vs(24.0±3.0)μmol/L。P值均小于0.01。
3.CGS21680对狼疮小鼠血清抗dsDNA抗体的影响
CGS21680治疗8周后,CGS21680治疗组血清抗dsDNA抗体水平与狼疮肾炎模型组相比显著下降,为(142.8±44.7)μg/ml vs(397.2±86.2)μg/ml,P<0.01。
4.CGS21680对狼疮小鼠脾脏和淋巴结重量的影响
CGS21680治疗8周后,脾脏和淋巴结重量绝对值有所下降,但无统计学差异。分别为(251±133)mg vs(378±198)mg,p>0.05:(134±42)mg vs(183±64)mg,p>0.05。
5.CGS21680对狼疮小鼠组织学的影响
CGS21680治疗8周后,治疗组肾小球损伤评分、肾小管间质损伤评分、肾血管炎症评分及唾液腺炎症评分明显下降,与模型对照组比较有统计学差异。治疗组和对照组肾小球评分分别为(1.33±0.10)vs(1.97±0.1),肾小管间质评分分别为(0.25±0.05)vs(0.93±0.19)；肾血管评分分别为(0.60±0.18)vs(1.30±0.32)；唾液腺炎症评分分别为(0.64±0.16)vs(0.96±0.18)。p值均小于0.01。
6.CGS21680对狼疮小鼠肾脏炎症细胞浸润的影响
CGS21680治疗8周后,肾小球、肾小管间质及血管周围巨噬细胞和T细胞的浸润较狼疮肾炎模型组均明显减少。
治疗组和模型对照组肾小球巨噬细胞浸润数分别为(0.8±0.1)细胞/gcs vs(2.6±0.3)细胞/gcs；肾小管间质分别为(10.5±1.6)细胞/hpf vs(39.1±5.1)细胞/hpf；血管周围分别为(36.1±4.4)细胞/血管 vs(257.6±56.1)细胞/血管。p值均小于0.01。
治疗组和模型对照组肾小球T细胞浸润数分别为(0.1±0.09)细胞/gcs vs(0.7±0.2)细胞/gcs；肾小管间质分别为(2.2±0.8)细胞/hpf vs(7.5±2.3)细胞/hpf；血管周围分别为(23.4±3.7)细胞/血管 vs(83.1±15.8)细胞/血管。p值均小于0.01。
7.CGS21680对狼疮小鼠肾脏IgG和C3沉积的影响
CGS21680治疗后,狼疮小鼠肾脏IgG和C3沉积明显减少。治疗组和模型对照组肾脏IgG荧光评分分别为(0.80±0.12)vs(2.88±0.24),C3分别为(0.65±0.15)vs(2.24±0.09)。p值均小于0.01。
8.CGS21680对狼疮小鼠MHCⅡ表达的影响
免疫组化染色显示,CGS21680治疗后狼疮小鼠肾脏MHCⅡ染色阳性细胞显著减少；RT-PCR结果显示,CGS21680治疗后狼疮小鼠肾脏MHCⅡmRNA表达显著降低(0.08±0.03)vs(0.44±0.09),p<0.01,与免疫组化结果一致。
9.CGS21680对狼疮小鼠IFN-γ和MCP-1mRNA的影响
RT-PCR结果显示,CGS21680治疗后狼疮小鼠肾脏IFN-γ和MCP-1转录水平与模型对照组相比降低了59％和58％。p值均小于0.01。
10.CGS21680对狼疮小鼠肾脏A2AR表达的影响
CGS21680对狼疮小鼠肾脏A2AR的表达并无影响。治疗组和模型对照组A2AR mRNA和蛋白水平无明显差异,p>0.05。
三、小结本研究发现在MRL/lpr狼疮小鼠中,使用CGS21680选择性激活A2AR:
1.减少MRL/lpr狼疮小鼠尿蛋白的排泄,改善肾功能；
2.减轻肾小球、肾小管间质及肾血管损害；
3.抑制肾脏炎症细胞浸润；
4.减少肾脏IgG和C3沉积；
5.抑制肾脏MCP-1、IFN-γ及MHCⅡmRNA的表达；
6.降低血清抗dsDNA抗体水平。
第三章CGS21680对MRL/lpr小鼠脾细胞增殖活化的影响
一、材料和方法
1.脾细胞分离及分组
分离MRL/Ipr小鼠脾细胞,分为:PBS组、LPS1.0μg/ml组、LPS1.0μg/ml+CGS2168010μM组(LC组),培养12h和24h,收样本分别提取总RNA、核蛋白及上清液。
2.RT-PCR
提取脾细胞总RNA,RT-PCR检测MHCⅡ、MCP-1和IFN-γmRNA,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。
3.Western Blot
提取脾细胞核蛋白,Western Blot检测NF-κB p65,以Fibrillarin为内参照,计算与内参照比值。
4.MTT
分离MRL/lpr小鼠脾细胞,按上述分组培养24 h,MTT检测细胞增殖。
5.ELISA
分离MRL/lpr小鼠脾细胞,按上述分组培养24 h,ELISA检测细胞上清IFN-γ水平。
6.统计学分析
均数比较采用方差分析(ANOVA),p<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.CGS21680对MRL/lpr小鼠脾细胞增殖的影响
与PBS相比,LPS刺激后脾细胞增殖显著增加；与LPS组相比CGS21680处理后,LC组LPS诱导的增殖显著降低(0.46±0.03)vs(0.93±0.08),p<0.01。
2.CGS21680对MRL/lpr小鼠脾细胞IFN-γ、MCP-1和MHC-ⅡmRNA的影响
与PBS组相比,LPS刺激后脾细胞IFN-γ、MCP—1和MHC—Ⅱ mRNA表达显著增加；与LPS组相比CGS21680处理后,LC组IFN-γ、MCP-1和MHC-ⅡmRNA表达降低了50％,52％和50％,p<0.01。
3.CGS21680激活A2AR对MRL/lpr小鼠脾细胞NF-κB活化的影响
与PBS组相比,LPS刺激后脾细胞细胞核内NF-κBp65显著增加；与LPS组相比CGS21680处理后,LC组脾细胞核内NF-κBp65显著降低,p<0.01。
4.CGS21680对MRL/lpr狼疮小鼠脾细胞IFN-γ分泌的影响
与PBS组相比,LPS刺激后脾细胞分泌IFN-γ显著增加；与LPS组相比CGS21680处理后,LPS诱导的脾细胞IFN-γ分泌显著降低(454.8±89.4)pg/ml vs(569.8±76.1)pg/ml,p<0.05。
三、小结
1.LPS刺激诱导MRL/lpr小鼠脾细胞增殖,活化NF-κB,上调MCP-1、IFN-γ及MHCⅡ分子的表达,增加IFN-γ分泌；
2.激活A2AR抑制MRL/lpr小鼠脾细胞增殖,抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的活化,显著下调MCP—1、IFN-γ及MHCⅡ分子表达,降低IFN-γ分泌。
全文总结
本研究发现体内选择性激活A2AR可抑制MRL/lpr小鼠肾脏MHCⅡ分子的表达,抑制肾脏趋化因子MCP-1及促炎症细胞因子IFN-γ的表达,降低血中自身抗体水平,减少肾脏炎症细胞浸润及免疫复合物沉积,减轻肾脏病理和功能损害,表明A2AR在MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的致病中发挥重要作用。体外研究表明激活A2AR能抑制LPS诱导的MRL/lpr狼疮小鼠脾细胞增殖和NF-κB信号通路的活化,减少IFN-γ的分泌,下调MCP-1、IFN—γ及MHCⅡ分子表达而发挥抗炎效应。
本研究表明A2AR信号通路对MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的进展具有保护作用,有望成为狼疮肾炎治疗的新靶点。