论文部分内容阅读
漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)是一类隶属于铜蓝氧化酶家族的多酚氧化酶,通常以分子氧为受体催化底物进行单电子氧化,是一种高效的绿色催化剂。通过与一些小分子介体物质构成漆酶介体系统(LMS),可进一步拓宽漆酶作用范围。通过纳米固定化技术,可提高漆酶的稳定性和重复性,在环境污染物及木质素降解方面具有巨大的应用潜力。裸脚菇属(Gymnopus)真菌是小皮伞科的重要类群,在森林生态系统的碳素循环中扮演着重要的分解者作用,其种类繁多、系统发育关系复杂,已有研究主要围绕在系统分类方面,而木质纤维素降解酶鲜有报道。本研究以采集并分离自云南楚雄的裸脚菇子实体为材料,开展分离鉴定、菌丝最适培养条件、胞外木质素降解酶活性、Cu2+诱导产漆酶活性、胞外漆酶分离纯化、漆酶介体系统、纳米二氧化硅固定化漆酶制备,以及对染料脱色应用等研究,具体内容如下:1、采用形态学和转录间隔区(ITS)鉴定确定YAASM5159菌株为蜡质裸脚菇(Gymnopus luxurians)。采用单因子实验确定该菌株菌丝最适培养条件包括:碳源为淀粉,氮源为酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏,C/N比范围50-60/1,生长因子VB1,温度范围26-28℃,pH 6.5。添加0.25 mmol/LCu2+的PD培养基、10%(V/V)接种量、28℃、150 rpm震荡培养7 d,漆酶活性达到18.73 U/mL,是同时刻空白对照组的3.17倍。2、以液体发酵粗酶液,采用三步离子交换层析和一步凝胶过滤层析获得纯化胞外漆酶(GLL),回收率为42.04%,纯化倍数为41.22倍,比活性为306.73 U/mg。结合FPLC和SDS-PAGE,确定GLL是分子量为64 kDa的单亚基蛋白。采用Edman降解法获得N-末端部分序列AIGPVTDLHI,与香菇、珊瑚状猴头菌、革耳等漆酶蛋白相似性为100%。以ABTS为底物的条件下,GLL的最适反应温度范围为55-65℃,最适pH值为2.2。1.25-10 mM的K+、Na+和Mg2+能够显著提高漆酶活性,而Cu2+、Mn2+、Ca2+、Cd2+、Co2+和EDTA对漆酶具有抑制作用,在37℃、pH 2.2、以ABTS为底物的条件下,漆酶的Km和Vmax 分别为 539.07 μmmol/L 和 3.12 μmol/min。3、利用7种常见小分子介体和GLL(0.45 U/mL),筛选对14种染料最佳的漆酶介体系统(LMS)。结果表明,GLL最适介体为乙酰丁香酮(AS)和丁香醛(SA),在25℃、pH 4.0、介体浓度为0.1mmol/L的条件下,2种LMS对考马斯亮蓝、孔雀石绿、活性黑和曲利苯蓝具有良好的脱色能力。进一步确定2种LMS染料脱色的最适反应条件为:最适温度为25-60℃,pH为4.0,介体浓度为0.1 mmol/L,反应4 h后,对4种染料的脱色率均达到 50-90%。4、以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为改性剂,以磁力搅拌油浴加热法,对商品化二氧化硅纳米粒子表面进行氨基修饰,获得SiO2-H纳米粒子,进一步以SiO2-H纳米粒子为载体、戊二醛为交联剂,对目标漆酶(0.03 U/mL)进行固定化,制备纳米固定化漆酶SiO2-H-GLL。傅里叶红外光谱结果表明,GLL通过氨基与载体结合。进一步优化固定化条件为:戊二醛浓度为1%、交联时间为40 min、GLL添加量为0.04U/mL、固定化时间为2 h,此时固定化效率为91.81%。以愈创木酚为底物,SiO2-H-GLL最适反应温度为60℃,最适pH为2.2,温度稳定性显著提高,并对孔雀石绿具有良好的脱色能力及重复使用率,4 h时脱色率最高可达到91.18%,重复4次时脱色率依然维持在90%左右,重复8次时脱色率为40%左右。本研究首次获得了纯化的裸脚菇属真菌漆酶蛋白GLL,成功制备纳米SiO2固定化漆酶SiO2-H-GLL,建立漆酶介体系统,对孔雀石绿等染料具有良好的脱色效果,在环境污染物生物降解领域具有良好应用前景。