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稻瘟病严重影响水稻产量和质量,是水稻生产中最重要的病害之一,我国稻瘟病在流行的年份,重病区一般减产10％-20％,严重的达40％-50％,局部田块甚至颗粒无收。近年来,由于分子生物学和基因工程技术的快速发展,通过植物转基因技术,结合常规育种可以选育优良转基因水稻新品种。
本研究室在以前的研究中将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的hrf1基因利用根癌土壤杆菌介导的转基因方法将其导入粳稻品种R109得到了转基因后代12-2。对已获得的R109转基因水稻在温室和田间小区进行抗性鉴定,发现转基因系对稻瘟病多个小种抗性明显提高,是一种广谱意义上的抗性。转基因系和出发植株间表现出的这种差异为后续研究提出了一个新的课题——差异表达基因的克隆及其功能验证。
基因芯片(gene chip)是将大量的靶基因片段有序的、高密度的固定在玻璃、硅等载体上制作而成的。基因表达谱芯片是目前应用最广泛的基因芯片。本研究在先前研究的基础上,借助水稻表达谱芯片进行高通量、大规模的分析、鉴定和筛选转基因抗稻瘟病水稻与转基因受体植株之间的差异表达基因,从中筛选到了92个差异表达显著的基因,在这92个基因中,显著上调的基因有70个,显著下调的基因有22。我们从显著上调的基因中选择了23个作为候选基因,通过RT-PCR和Real time PCR验证最终确定了7个基因作为我们的目标基因。
针对通过芯片得到的差异表达基因,本文应用Gateway技术进行目标基因RNA沉默载体的构建。以7个目标基因中的OS-4为例,构建成功了pSTARGATE::OS-4重组质粒,该重组质粒可直接用于水稻的转基因研究。该技术为RNA沉默研究提供了一种新的方法学上的参考。
此外,本文还进行了利用常规方法构建RNA沉默载体的研究。