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目前，全球有三分之一的人口感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，我国是结核病(tuberculosis，TB)负担大国。MTB成为人类主要病原体的一个重要原因是MTB在人体内能够形成潜伏感染而长期存在[12]。传统的抗TB药物只对TB活动期的MTB有效，而对潜伏感染状态的MTB则不能发挥作用。卡介苗（BCG）是目前唯一预防TB的疫苗，但其对成年人TB保护力不佳，主要原因之一是BCG不能增强宿主对潜伏感染状态MTB的免疫应答。因此，研究能够预防或治疗潜伏感染期MTB的新型疫苗对于控制TB具有重要意义。以往研究表明，MTB在潜伏感染期主要以MTB休眠菌状态存在，并能够特异性表达与其休眠相关的蛋白，这些蛋白由休眠调节子DosR(dormancy regulon)基因编码，共48个。目前关于这些休眠相关蛋白的功能研究还较少，已知在这些蛋白中，Rv2031c和Rv2626c在MTB的潜伏感染中起到重要作用，它们在潜伏感染期大量表达，是潜伏感染的标志，而其具体功能仍知之甚少。MTB休眠相关蛋白具有较强的免疫原性，其中8个蛋白的免疫原性最强，包括Rv2031c和Rv2626c，它们能和MTB持续感染者的T细胞发生特异性免疫反应，刺激T细胞增殖，释放IFN-γ和IL-2。因此，近来研究也将这些MTB休眠相关蛋白作为TB新型疫苗研究的重要候选抗原。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种速生非致病性分枝杆菌，由于其与MTB同源，可作为MTB蛋白功能研究的一个有利载体。用其表达MTB抗原，不仅蛋白表达量高，而且能高度保持MTB抗原的空间结构和生物学功能。此外，MS同BCG一样，具有较强的免疫原性，可作为新的活疫苗载体用于各类疾病疫苗的研究，包括TB。本研究选择MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c作为靶蛋白，以MS作为表达载体，构建能够表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组MS（recombinant Mycobacterium smegmatis，rMS）。通过对rMS的生物学特性，rMS与体外小鼠巨噬细胞的相互作用，以及rMS刺激小鼠的免疫应答观察，进一步探索MTB休眠相关蛋白Rv2031c和Rv2626c的功能，并评价表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的rMS作为TB新型疫苗的研究前景。一、表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白重组耻垢分枝杆菌的构建与鉴定采用PCR方法，从MTB H37Rv基因组DNA中扩增获得MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段，大小分别为435bp和480bp。同时利用引物设计，在Rv2626c上游引物中引入48bp的疏水性linker，以保障Rv2031c-Rv2626c融合蛋白中单个蛋白构象的正确折叠。将各基因PCR产物克隆入pMD18-T载体进行测序，结果与Genbank公布的基因序列完全一致。利用限制性酶切方法在pMD18-T载体中构建Rv2031c-Rv2626c融合基因，将Rv2031c-Rv2626c融合基因亚克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中，将重组质粒电穿导入MS感受态，构建筛选重组MS，命名为Rv2031c-Rv2626c-rMS（rMS）。rMS的PCR鉴定表明能够特异性扩增获得Rv2031c-Rv2626c融合基因片段。将rMS在42℃热诱导表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，rMS能够特异性表达目的蛋白，大小约为35kDa，与理论值相符。Western-blot结果表明，目的蛋白能与抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体发生特异性的反应，反应条带大小位置相一致。7H10固体平板培养rMS，观察rMS的菌落形态。结果发现，与原菌株MS相比，rMS菌落形状偏圆，颜色偏白。7H9液体培养基培养rMS，绘制细菌生长曲线，结果表明，与MS相比，rMS生长速率无明显变化。二、rMS与小鼠巨噬细胞的相互作用将rMS和MS在体外以10:1（细菌：细胞）的MOI感染小鼠巨噬细胞RAW264.7。感染3h后,无菌D-Hanks液洗涤细胞，清除胞外细菌后继续培养，并将此时计为感染0h。在感染后12h，使用抗酸染色、扫描电镜和透射电镜对感染的巨噬细胞进行形态学观察。结果发现，rMS和MS均能在体外感染小鼠巨噬细胞。在感染巨噬细胞内能观察到抗酸染色阳性的细菌，扫描电镜可观察到巨噬细胞正以直接摄入或胞吞的方式吞噬分枝杆菌，透射电镜可观察到rMS和MS感染巨噬细胞后能够诱导细胞发生凋亡和坏死。计数巨噬细胞感染后24h的活细胞数。结果表明，rMS组活细胞数（3.9±0.01）低于MS组（4.7±0.01），差异有统计学意义（P<0.05），提示rMS细胞毒性强于MS。在感染巨噬细胞后3h、6h、12h、24h和27h，计数感染细胞内活菌数CFU。结果表明，MS在巨噬细胞内逐渐被吞噬消化，而rMS则在巨噬细胞内可以繁殖，延长在巨噬细胞内的存活时间，提示所构建的Rv2031c-Rv2626c融合蛋白在MS中的表达，能够发挥一定的MTB休眠相关蛋白的功能，增强MS在巨噬细胞内的存活能力，延长存活时间。流式细胞仪检测感染巨噬细胞发生的凋亡率和坏死率。结果显示，与空白组相比，rMS和MS均可诱导细胞发生凋亡和坏死，rMS组的细胞凋亡率（53.6%±3%）低于MS组（79.9%±3%）（P<0.05）；rMS组细胞坏死率（22%±3%）高于MS组（12%±2%）（P<0.05）。表明rMS诱导巨噬细胞凋亡能力低于MS组，而诱导坏死能力高于MS组，但仍主要以诱导细胞凋亡为主。ELISA检测感染巨噬细胞分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α的水平和释放NO的浓度。结果显示，rMS诱导巨噬细胞分泌IFN-γ和IL-6的水平高于MS（P<0.05），但分泌TNF-α和NO的水平低于MS（P<0.05）。表明rMS和MS均能诱导活化巨噬细胞功能，但具体的活化机制存在差异。三、rMS刺激小鼠的特异性免疫应答研究采用rMS和MS以107CFU/0.1mL，BCG0.2mg/0.1mL分别背部皮下免疫BALB/c小鼠，每组10只，同时将正常小鼠作为阴性对照组。免疫4周后，分离免疫小鼠血清，ELISA检测其抗体水平和抗体亚类。结果发现，rMS免疫小鼠的抗体中能够检测到针对Rv2031c和Rv2626c的特异性抗体，表明rMS免疫小鼠后能够在体内表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白，并且融合蛋白能够发挥单个蛋白的免疫原性。rMS免疫小鼠血清抗体总体水平高于MS组和BCG组（P<0.05）。抗体亚类含量测定结果表明，rMS同MS和BCG一样，均能诱导小鼠产生IgG1和IgG2a抗体，但主要以IgG1为主（P<0.05）。分离各组免疫小鼠脾淋巴细胞，WST法检测脾淋巴细胞抗原特异性增殖指数（SI），结果显示，Rv2031c和Rv2626c蛋白单个或联合刺激均能使rMS组小鼠脾淋巴细胞发生增殖，但以蛋白联合刺激时的SI最高（SI≥3），表明Rv2031c和Rv2626c的融合表达具有免疫协同增强作用。rMS组小鼠脾淋巴细胞抗原特异性SI高于MS组和BCG组（P<0.05）。流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞所占百分比，结果显示，rMS、MS和BCG与空白对照组相比均能刺激小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞所占百分比的增加（P>0.05）。rMS组小鼠的CD4+T细胞的所占百分比高于MS和BCG组（P<0.05），而CD8+T细胞所占百分比与MS和BCG组无统计学差异（P>0.05）。ELISA检测脾淋巴细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的水平。结果显示，rMS组小鼠的IFN-γ、IL-2水平均高于MS组和BCG组（P<0.05），而且Rv2031c和Rv2626c联合刺激rMS免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2水平均高于各单个蛋白刺激所分泌的（P<0.05），这一结果与脾淋巴细胞增殖实验结果相一致，也再次表明Rv2031c和Rv2626c具有免疫协同增强作用。终上所述，MS表达的MTB休眠相关蛋白Rv2031c-Rv2626c能够发挥一定的Rv2031c和Rv2626c单个蛋白的功能。同时，表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的rMS与MS和BCG相比，能够刺激机体产生较强的抗原特异性免疫应答，这为以MTB休眠相关蛋白作为候选抗原和以MS作为载体研制TB新型疫苗奠定了一定的理论基础，值得进一步深入研究。