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目的:氧化应激在年龄相关性黄斑变性的发病机制中发挥重要作用。本研究观察Canolol对外源性t-BuOOH(t-BH)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE-19细胞)的氧化损伤的保护作用及其相关的分子机制。
方法:应用外源性t-BH作用于ARPE-19细胞，建立ARPE-19细胞氧化应激损伤模型。MTT法检测细胞活性，2，7-二氯荧光乙酞乙酸钠(H2DCFDA)荧光探针检验细胞内氧自由基(ROS)水平，Annexin V FITC-PI双染法检测细胞凋亡，确定t-BH的最佳作用浓度和时间。MTT法检测细胞活性、H2DCFDA荧光探针检测细胞内ROS的水平、流式细胞仪检测细胞凋亡，观察Canolol对t-BH诱导的ARPE-19细胞氧化应激损伤的保护作用。试剂盒方法检测细胞SOD水平，RT-PCR方法检测氧化应激相关因子HO-1、catalase、Nrf-2、GST-pi的变化以及Western-blot方法检测ERK磷酸化的变化情况，探讨Canolol对视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的保护作用的机制。
结果:MTT法细胞活性检测、H2DCFDA荧光探针法细胞内ROS水平检测、流式细胞仪细胞凋亡检测结果发现，外源性t-BH可使ARPE-19的细胞活性下降，细胞内ROS浓度升高，细胞凋亡增加，且呈剂量依赖性。进一步，我们加入Canolol预处理24h，发现Canolol对ARPE-19细胞氧化应激损伤具有明显保护作用，表现为细胞活性增加，细胞内ROS浓度降低，细胞凋亡率降低。RT-PCR结果显示Canolol能够诱导抗氧化酶，包括SOD活性和HO-1、catalase、GST-pi的mRNA表达增加，并且与Nrf-2 mRNA表达增加呈一定相关性。进一步western-blot结果发现，Canolol在ARPE-19细胞正常和应激条件下均可诱导ERK的磷酸化水平表达增加，并且可被ERK特异性抑制剂U0126部分阻断，说明Canolol的细胞保护作用可能通过激活ERK信号通路。
结论:外源性t-BH可成功诱导ARPE-19细胞氧化应激模型。Canolol对ARPE-19细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用，其分子机制尚不十分清楚，但可能与Canolol诱导ARPE-19细胞抗氧化酶(SOD、HO-1、GST-pi、catalase)的表达增加有关，而这种作用可能通过激活Nrf-2和ERK信号通路。