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研究背景脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其发病率高,死亡率高,治疗困难,目前还没有完全有效的治疗方法。虽然其发病机理尚不完全明确,但普遍认为其发生和发展是多个癌基因过度表达和抑癌基因失活的结果。其中抑癌基因的失活起了很重要的作用,近期的研究表明,组蛋白乙酰化水平与肿瘤的产生、增殖和抑癌基因的表达水平有着密切的关系。因此,通过对抑癌基因作用途径的研究,弄清脑胶质瘤的发病机制,为其治疗带来希望。NDRG2基因是我们课题组首次于1999年用消减杂交法从人脑内克隆的一个新的抑癌候选基因。同源性分析表明,其与NDRG1具有高度的同源性,并含有一个能携带酰基的酰基携带蛋白结构域,故称为NDRG2。前期的研究表明,其在体内分布广泛,在终末分化的细胞中高表达;在增殖旺盛的组织中低表达;在同一组织内,在胚胎和新生期中低表达,在成年的相同组织中高表达。研究还发现NDRG2为多种肿瘤组织与相应正常组织的差异表达基因,在胶质瘤的组织和细胞系中,发现其表达明显的降低。同时在胶质瘤中过表达NDRG2基因时,发现其可抑制肿瘤细胞增殖,发生周期阻滞。我们初步明确其不但是一种抑癌候选基因,更是一种与细胞生长发育和分化增殖调控相关的重要基因。近期来的研究表明,抑癌基因的作用途径多与表观遗传学有关,目前发现的表观修饰主要包括DNA的甲基化,组蛋白的甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化和非编码RNA的调控染色质的再修饰等。在组蛋白的修饰中,研究最多的是组蛋白的乙酰化。结合对NDRG2的生物信息学分析结果,因其分子内含有一个可以携带酰基的酰基携带蛋白结构域,NDRG2作为一种与细胞生长发育和分化增殖相关的重要基因,其很可能参与了组蛋白乙酰化或去乙酰化过程。从来没有人对于NDRG2与组蛋白乙酰化或去乙酰化的关系进行研究。目前对于组蛋白乙酰化和去乙酰化调控基因转录机制的研究还处于初级阶段。组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰是基因转录调控的重要机制之一。组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是组蛋白乙酰化的关键酶,其决定着组蛋白乙酰化的程度,参与了肿瘤异常基因表达。组蛋白乙酰化机制与肿瘤细胞增殖和分化有着密切的关系。曲古抑菌素A(TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,其通过结合在组蛋白去乙酰化酶分子的催化中心,而可逆或非可逆地抑制HDAC的活性;作用于细胞,可引起染色体组蛋白广泛的乙酰化,从而提高组蛋白的乙酰化水平,调节某些基因的表达。研究表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)具有调节细胞周期,诱导多种肿瘤细胞株的生长停滞、分化或凋亡。为了深入研究NDRG2的功能,明确NDRG2与组蛋白乙酰化的关系,同时为进一步探索胶质瘤发病机制和新的治疗策略,本课题组拟通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理,并利用腺病毒载体和siRNA技术转染人脑胶质瘤细胞系后观察NDRG2和组蛋白乙酰化的表达情况,进一步对该基因进行深入研究。实验方法1.首先利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理脑胶质瘤细胞系U251和U87,观察其细胞生长曲线,细胞周期的变化,并用Real-time PCR和Western blot方法观察了NDRG2和组蛋白乙酰化H3,H4和HDAC1的表达情况。2.利用腺病毒重组NDRG2载体转染脑胶质瘤细胞系U251后,用Real-time PCR和Western blot方法观察外源性过表达NDRG2后对组蛋白乙酰化H3,H4和HDAC1的水平的影响。3.用siRNA瞬时转染脑胶质瘤细胞系U251后,仍采用Real-time PCR和Western blot方法观察化学合成的三对NDRG2特异性siRNA的干涉效果,同时观察抑制NDRG2的表达后对上述三种蛋白表达的影响。实验结果1.TSA可明显抑制U251和U87细胞增殖,并引起细胞周期阻滞。TSA刺激后可同时上调NDRG2和组蛋白乙酰化H3和H4的表达,降低HDAC1的水平。2.在蛋白水平,外源性过表达NDRG2可以上调组蛋白H3和H4的乙酰化水平,对HDAC1的表达降低不明显。但在mRNA水平,过表达NDRG2可显著降低HDAC1的表达量。3.我们首先用Real-time PCR和Western blot方法验证了NDRG2siRNA的干涉效果,化学合成的三对NDRG2特异性siRNA均有效抑制NDRG2的表达量。在mRNA水平,抑制NDRG2的表达可以提高HDAC1的表达水平。在蛋白水平,抑制NDRG2的表达可以降低组蛋白乙酰化H3和H4的表达量,同样对HDAC1的表达量升高不明显。结论1.TSA能够抑制脑胶质瘤细胞U251和U87的增殖,并发生周期阻滞,未出现凋亡。2.TSA能够同时提高NDRG2和组蛋白乙酰化水平,降低HDAC1的表达量。3.NDRG2能够同时调节组蛋白乙酰化和去乙酰化水平,参与了组蛋白乙酰化/去乙酰化过程,但NDRG2是通过什么方式影响组蛋白乙酰化过程的变化呢?还有待我们进一步研究。