半夏凝集素基因的克隆及抗虫小麦新种质的创制

• 作 者: 马员春
• 机 构: 宁夏大学
• 出 处: 宁夏大学
• 发表日期: 2010年期
• 关键词: 半夏 凝集素基因 基因克隆 小麦 抗虫育种 转基因技术

半夏凝集素蛋白具有只与甘露糖结合的特性，而人体以及哺乳类动物体内的甘露糖很少，最新研究表明：半夏凝集素蛋白对刺吸式害虫有良好的毒杀和抑制作用，因此，半夏凝集素基因可应用于作物抗虫育种。本研究通过RT-PCR方法克隆了半夏凝集素基因Pta，采用基因枪共转化法转化小麦，获得了转Pta基因的轮选987的T1代植株和科农199的T0代植株。主要研究结果如下：　　
1.以野生半夏为材料提取mRNA,根据NCBI公布的序列设计引物，通过RT-PCR方法克隆了半夏凝集素基因，该基因编码区长为807bp，编码269个氨基酸，与NCBI上的序列完全吻合。　　
2.构建了高效表达载体pRTL2-Pta，并与含有抗除草剂筛选标记的pHAC20(Bar基因)质粒载体相混合，通过基因枪共转化法转化了轮选987成熟胚愈伤组织1049块，获得了T0代抗性再生植株99株，经PCR检测，含Pta基因、不含Bar基因的植株7株；含Bar基因、不含Pta基因的植株25株；两个基因同时存在的植株42株，目的基因Pta的转化效率为4.6％左右。　　
3.通过特异酶切目的基因表达盒片段的回收，采用Pta基因线性表达盒转化小麦科农199幼胚愈伤组织840块，获得167株抗性再生植株。PCR检测获得目的基因片段扩增阳性植株26株。目的基因Pta的转化效率为3.1％。　　
4.初步调查结果显示，轮选987转基因阳性植株分蘖能力强，穗纺锤型，穗长7-10cm之间，多为9cm左右，农艺性状良好。T1代初步抗虫鉴定结果显示：部分转基因阳性植株在自然条件下蚜虫的发生率明显低于受体对照。部分株系抗虫性与室内苗期对麦长管蚜抗性鉴定结果吻合。　　
综上所述，本研究克隆到的半夏凝集素基因已插入普通小麦轮选987和科农199的基因组中，半夏凝集素转基因小麦，尤其是剔除筛选标记基因以及载体骨架序列的半夏凝集素转基因小麦的获得，为培育更加安全的抗虫小麦奠定了材料基础，对减少化学药剂的使用，保护环境有着重要的意义。