论文部分内容阅读
人口老龄化会面临各种退行性疾病的高发。其中，神经系统的退行性疾病占有很大的比例。本课题主要围绕帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的细胞疗法展开研究，为之后研究中脑DA神经元的发育路径，PD发病机制和开展PD的细胞疗法奠定了坚实的基础。
PD的发病机制主要是中脑黑质(substantia nigra pars compacta, SNc)区域DA神经元的死亡导致多巴胺(dopamine, DA)分泌量减少。开展PD的细胞治疗，最重要的是要得到源源不断的供体细胞，即DA神经前体细胞。本课题主要研究目标是建立DA神经元的分化体系，为PD的细胞疗法提供细胞。采用的策略是将人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells, hESCs )定向分化为DA前体细胞从而得到供体细胞。首先，通过添加特定组合的因子将hESCs诱导分化为神经底板细胞(neural floor plate cells , NFP )，这部分细胞能够表达神经底板细胞的标志物LMX1A,FOXA2,OTX2。然后，经过FGF8等因子的诱导，神经底板细胞能够分化为DA前体细胞，这些细胞能够表达中脑的标志物LMX1A,FOXA2,EN1。我们将其体外培养发成熟为多巴胺神经元后，它能够表达成熟DA神经元的标志物TH,TUJ1。
为了探究不同hESCs的分化潜力是否存在差异，我们采用了12株hESCs进行了DA的分化。实验结果证明，不同hESCs分化产生的DA神经前体细胞的效率是不同的，并筛选出了一株DA分化潜力较高hESCs，为DA的分化提供种子细胞。
目前建立的DA神经元的化体系仍有不足之处。第一个不足之处是：DA前体细胞的标志物LMX1A的表达比例过低。通过查阅文献发现LMX1A在发育上是由WNT通路调控的，而CHIR99021是WNT通路的激活剂，所以我们利用了H9-LMX1A的报告细胞系对CHIR99021的最适浓度进行了筛选，进而上调LMX1A的表达水平。第二个不足之处是试剂不符合临床要求。由于基础级B27中含有BSA成分，我们更换为临床级B27。实验结果证明临床级B27可以较好的取代基础级B27。第三个不足之处是DA神经元的分化效率较低。本课题使用两种方法来提高DA神经元的分化效率。一种提高效率的方法是通过延长两种营养因子GDNF和TGFβ3的作用时间来为DA神经元提供分化所需的营养物质，进而提高LMX1A，FOXA2，EN1，TH，TUJ1的表达比例。另一种方法是在ES细胞诱导分化为神经细胞的过程中，通过降低高SHH的浓度，同时加入SHH的激活剂PP来增强腹侧化程度来提高DA神经元的分化效率。从分化成本上看，SHH是一种蛋白质，价格较贵，这样也可以减少DA神经元的分化的成本，这为后续大量提供DA细胞治疗PD提供了很大的帮助。
综上所述，本课题主要包括三个部分：DA神经元分化体系的建立，不同hESCs向DA分化潜力的差异性研究，DA神经元分化体系的优化。这不仅为PD的细胞治疗提供了充足的供体细胞，还为DA分化体系的优化提供了宝贵经验。
PD的发病机制主要是中脑黑质(substantia nigra pars compacta, SNc)区域DA神经元的死亡导致多巴胺(dopamine, DA)分泌量减少。开展PD的细胞治疗，最重要的是要得到源源不断的供体细胞，即DA神经前体细胞。本课题主要研究目标是建立DA神经元的分化体系，为PD的细胞疗法提供细胞。采用的策略是将人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells, hESCs )定向分化为DA前体细胞从而得到供体细胞。首先，通过添加特定组合的因子将hESCs诱导分化为神经底板细胞(neural floor plate cells , NFP )，这部分细胞能够表达神经底板细胞的标志物LMX1A,FOXA2,OTX2。然后，经过FGF8等因子的诱导，神经底板细胞能够分化为DA前体细胞，这些细胞能够表达中脑的标志物LMX1A,FOXA2,EN1。我们将其体外培养发成熟为多巴胺神经元后，它能够表达成熟DA神经元的标志物TH,TUJ1。
为了探究不同hESCs的分化潜力是否存在差异，我们采用了12株hESCs进行了DA的分化。实验结果证明，不同hESCs分化产生的DA神经前体细胞的效率是不同的，并筛选出了一株DA分化潜力较高hESCs，为DA的分化提供种子细胞。
目前建立的DA神经元的化体系仍有不足之处。第一个不足之处是：DA前体细胞的标志物LMX1A的表达比例过低。通过查阅文献发现LMX1A在发育上是由WNT通路调控的，而CHIR99021是WNT通路的激活剂，所以我们利用了H9-LMX1A的报告细胞系对CHIR99021的最适浓度进行了筛选，进而上调LMX1A的表达水平。第二个不足之处是试剂不符合临床要求。由于基础级B27中含有BSA成分，我们更换为临床级B27。实验结果证明临床级B27可以较好的取代基础级B27。第三个不足之处是DA神经元的分化效率较低。本课题使用两种方法来提高DA神经元的分化效率。一种提高效率的方法是通过延长两种营养因子GDNF和TGFβ3的作用时间来为DA神经元提供分化所需的营养物质，进而提高LMX1A，FOXA2，EN1，TH，TUJ1的表达比例。另一种方法是在ES细胞诱导分化为神经细胞的过程中，通过降低高SHH的浓度，同时加入SHH的激活剂PP来增强腹侧化程度来提高DA神经元的分化效率。从分化成本上看，SHH是一种蛋白质，价格较贵，这样也可以减少DA神经元的分化的成本，这为后续大量提供DA细胞治疗PD提供了很大的帮助。
综上所述，本课题主要包括三个部分：DA神经元分化体系的建立，不同hESCs向DA分化潜力的差异性研究，DA神经元分化体系的优化。这不仅为PD的细胞治疗提供了充足的供体细胞，还为DA分化体系的优化提供了宝贵经验。