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高血压是以长时间动脉血压升高为特征的疾病状态。根据发病原因的不同，高血压被分为两类：其中90-95%为原发性高血压，5-10%为继发性高血压。内皮功能受损和血管壁重构在高血压的发生发展过程中发挥重要作用。内皮功能受损会导致内皮源性收缩因子和舒张因子失衡，主要表现为舒张功能变差，收缩功能增强。平滑肌细胞是指围绕血管内皮细胞外侧构成血管壁的大部分细胞，其收缩和舒张影响了血管容积和血压，并且在动脉中含量高于静脉，过量的平滑肌细胞增殖加速了疾病的发生发展，比如动脉粥样硬化，肺源性高血压。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)作为继一氧化碳(carbon monoxide, CO)，一氧化氮(nitric oxide, NO)后被发现的第三种气体信号分子，其保护作用及其机制已受到广泛关注，H2S通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、调节自噬、调节离子通道的开放和关闭等多种途径发挥着降血压、保护心肌再灌注损伤、改善冠心病预后、延缓动脉粥样硬化的作用。虽然硫化氢在心血管系统中的保护作用之前已有报道，但大多集中在外源性补充硫化氢的治疗作用，内源性硫化氢在疾病发生发展中的作用及其分子机制目前远未完全阐明。本课题主要研究探讨内源性硫化氢减少对血管内皮功能和动脉管壁重构的影响，并深入探讨其分子机制。
第一部分：内源性硫化氢减少导致小鼠血压升高和内皮细胞功能受损
目的：观察内源性硫化氢减少对内皮功能和血压的影响
方法：选用CSE(cystathionine-gamma-lyase，胱硫醚-γ-裂解酶)WT和CSEKO雄性小鼠，16周龄，各16只，随机分为四组，WT+Vehicle组，WT+NaHS组，KO+Vehicle组，KO+NaHS组，经过8周腹腔注射生理盐水或者NaHS。C57BL/6J雄性小鼠，12周龄，16只，随机分为两组：Control组和PPG组，每天腹腔注射PPG连续4周。检测不同组的血压，血管舒张功能，血管中gp91phox，p67phox，NOX-4，TXNIP和p-eNOS蛋白表达。HUVECs分为对照组和PPG组，检测TXNIP，p-eNOS蛋白表达。
结果：
1.CSE-/-小鼠体内硫化氢含量降低，腹腔注射NaHS8周后，血浆中H2S含量升高至正常水平。
2.内源性硫化氢减少引起小鼠主动脉收缩压升高，动脉氧化应激水平升高；当外源性补充NaHS后，使得CSE-/-小鼠收缩压降低至正常水平。
3.硫化氢减少导致血管内皮功能受损，内皮依赖性舒张功能变差，NO生成减少，内皮细胞中NO的生成酶eNOS磷酸化降低，补充H2S可以逆转这些改变。
4.内源性硫化氢减少导致主动脉中TXNIP的mRNA和蛋白表达均增加，IHC结果显示TXNIP表达明显升高；Trx蛋白表达降低；外源性补充NaHS使TXNIP和Trx蛋白表达恢复正常。
5.PPG慢性注射导致H2S生成减少，内皮功能受损，主动脉内皮依赖性舒张功能变差，p-eNOS表达降低，TXNIP表达增加，与CSE-/-小鼠主动脉中蛋白变化趋势一致。
6.PPG促进人脐静脉内皮细胞TXNIP表达，抑制p-eNOS表达。
第二部分：MAPK/TXNIP通路介导内源性硫化氢减少导致的内皮细胞损伤
目的：研究证实内源性硫化氢减少通过MAPK/TXNIP通路导致内皮细胞损伤
方法：选用人脐静脉内皮细胞，将其分为Control组，PPG组，PPG+SB203580组(p38MAPK阻断剂)，PPG+PD98059组(ERKMAPK阻断剂)，PPG+SP600125(JNKMAPK阻断剂)，PPG+SB203580+PD98059+SP600125组，PPG+NaHS组，观察不同组中TXNIP和p-eNOS表达；使用TXNIPsiRNA处理人脐静脉内皮细胞，将其分为：Control组，ScramblesiRNA1组，ScramblesiRNA2组，TXNIPsiRNA1组，TXNIPsiRNA2组，PPG组，PPG+NaHS组，PPG+TXNIPsiRNA1组，PPG+TXNIPsiRNA2组，观察H2S和TXNIP敲低对细胞对影响；使用TXNIPPlasmid处理细胞，将其分为：Control组，EmptyPlasmid组，TXNIPPlasmid组，TXNIPPlasmid+SB203580组，TXNIPPlasmid+PD98059组，TXNIPPlasmid+SP600125组，TXNIPPlasmid+SB203580+PD98059+SP600125组，TXNIPPlasmid+NaHS组，观察TXNIP过表达对细胞的影响。
结果：
1.CSE-/-小鼠主动脉中MAPK表达增高，p38，ERK，JNK磷酸化增强，然而总p38，ERK，JNK表达并没有改变。
2.使用PPG抑制人脐静脉内皮细胞中硫化氢生成，使得p-p38，p-ERK，p-JNK表达升高，p-p38在PPG处理30min时达到最大效应，p-ERK和p-JNK在PPG处理10min达到最大效应，随后有所下降。
3.p38阻断剂SB203580，ERK阻断剂PD98059或者JNK阻断剂SP600125单独孵育血管均改善CSE-/-小鼠主动脉舒张功能；单独使用一种MAPK阻断剂孵育血管可以部分逆转CSE-/-小鼠主动脉中TXNIP和p-eNOS的表达，但不能恢复至对照组水平，当同时应用这三种阻断剂时，可以完全逆转TXNIP和p-eNOS表达，使其恢复到对照组水平。
4.单独使用一种MAPK阻断剂可以部分降低HUVECs中PPG刺激的TXNIP表达升高和部分升高PPG刺激的p-eNOS表达降低，当同时应用这三种阻断剂或者NaHS孵育细胞时，完全逆转PPG组TXNIP和p-eNOS表达，使其恢复至对照组水平。
5.TXNIPsiRNA抑制TXNIP蛋白表达，升高HUVECs中p-eNOS和Trx水平。
6.TXNIPsiRNA使PPG组TXNIP降低至正常水平，使PPG组p-eNOS和Trx升高至对照组水平，应用TXNIPsiRNA改善了PPG导致的内皮细胞损伤。
7.TXNIP过表达质粒明显升高细胞内TXNIP表达，降低p-eNOS和Trx表达；同时应用MAPK阻断剂如SB203580，PD98059，SP600125或者NaHS，对TXNIP，p-eNOS和Trx表达并无影响。
第三部分：PPARδ/SOCS3通路介导内源性硫化氢减少导致的动脉重构
目的：观察内源性硫化氢生成减少对动脉重构的影响及其信号通路。
方法：选用C57BL/6J12周龄，32只，随机分为四组，Vehicle组，NaHS组，PPG组，PPG+NaHS组。NaHS组接受8周的NaHS腹腔注射；PPG组和PPG+NaHS组接受8周的PPG腹腔注射；PPG+NaHS组在第5周起接受4周的NaHS腹腔注射，观察不同组主动脉的收缩功能和炎症水平；选用大鼠血管平滑肌原代培养，分为：Control组，NaHS组，PPG组，PPG+NaHS组，NaHS+GSK0660(PPARδ阻断剂)组，GSK0660组，PPG+GW501516(PPARδ激动剂)组，GW501516组，观察不同组平滑肌细胞内炎症因子表达和PPARδ，SOCS3，p-STAT3表达。
结果：
1.PPG腹腔注射小鼠主动脉收缩压升高，主动脉主动收缩和被动收缩能力均增强；补充NaHS使血压恢复正常水平，主动脉收缩恢复至对照组水平。
2.硫化氢减少导致血管中膜增厚，胶原蛋白在中膜沉积，collagenⅠ和MMP9蛋白表达升高，补充NaHS逆转上述变化。
3.内源性硫化氢缺乏促使平滑肌细胞由收缩表型向增殖表型转化，PPG组收缩表型蛋白αSMA和p27表达降低，增殖表型蛋白PCNA和CyclinE表达升高，补充H2S后收缩表型蛋白和增殖表型蛋白均恢复至对照组水平。
4.内源性硫化氢减少促使主动脉壁炎症因子TNFα、IL6和IL1β表达升高，外源性补充H2S使其恢复至对照组水平。
5.平滑肌细胞内硫化氢减少导致PPARδ和SOCS3表达降低；p-STAT3表达升高，补充H2S逆转上述变化，单独应用NaHS组中蛋白含量均与对照组一致。
6.平滑肌细胞内源性硫化氢减少导致collagenⅠ和MMP9蛋白表达升高，收缩表型蛋白αSMA，p27表达降低，增殖表型蛋白PCNA，CyclinE表达升高，补充H2S后使上述蛋白表达恢复至对照组水平。
7.平滑肌细胞内源性硫化氢减少使炎症相关蛋白TNFα、IL6和IL1β表达升高，同时应用NaHS可以逆转以上变化；硫化氢减少使PPARδ和SOCS3表达降低，p-STAT3表达升高，补充H2S使其恢复至对照组水平。
8.PPARδ的激活剂GW501516可激活下游的SOCS3蛋白，抑制STAT3的磷酸化；应用PPARδ的阻断剂GSK0660，则抑制SOCS3的表达，激活p-STAT3的表达。单独应用GW501516或NaHS则不引起SOCS3和p-STAT3的变化。
9.GW501516可以改善PPG预处理血管对Phenylephrine的收缩反应，也可以改善血管的被动收缩力，表现为血管对拉伸实验产生的张力减小；对NaHS孵育的血管同时应用GSK0660加剧了血管对Phe的收缩反应，增大血管的被动收缩力。
结论：内源性硫化氢在调控内皮细胞功能和动脉管壁重构中发挥重要作用。一方面，内源性硫化氢通过抑制MAPK/TXNIP通路，降低氧化应激水平，保护内皮细胞功能，维持血压恒定；另一方面，内源性硫化氢通过PPARδ/SOCS3信号通路，降低平滑肌细胞炎症因子表达，调节平滑肌表型和细胞外基质表达，维持血压恒定。上述研究结果为H2S的血管保护作用提供了新的证据，可能为高血压等心血管疾病提供新的治疗靶点和策略。
第一部分：内源性硫化氢减少导致小鼠血压升高和内皮细胞功能受损
目的：观察内源性硫化氢减少对内皮功能和血压的影响
方法：选用CSE(cystathionine-gamma-lyase，胱硫醚-γ-裂解酶)WT和CSEKO雄性小鼠，16周龄，各16只，随机分为四组，WT+Vehicle组，WT+NaHS组，KO+Vehicle组，KO+NaHS组，经过8周腹腔注射生理盐水或者NaHS。C57BL/6J雄性小鼠，12周龄，16只，随机分为两组：Control组和PPG组，每天腹腔注射PPG连续4周。检测不同组的血压，血管舒张功能，血管中gp91phox，p67phox，NOX-4，TXNIP和p-eNOS蛋白表达。HUVECs分为对照组和PPG组，检测TXNIP，p-eNOS蛋白表达。
结果：
1.CSE-/-小鼠体内硫化氢含量降低，腹腔注射NaHS8周后，血浆中H2S含量升高至正常水平。
2.内源性硫化氢减少引起小鼠主动脉收缩压升高，动脉氧化应激水平升高；当外源性补充NaHS后，使得CSE-/-小鼠收缩压降低至正常水平。
3.硫化氢减少导致血管内皮功能受损，内皮依赖性舒张功能变差，NO生成减少，内皮细胞中NO的生成酶eNOS磷酸化降低，补充H2S可以逆转这些改变。
4.内源性硫化氢减少导致主动脉中TXNIP的mRNA和蛋白表达均增加，IHC结果显示TXNIP表达明显升高；Trx蛋白表达降低；外源性补充NaHS使TXNIP和Trx蛋白表达恢复正常。
5.PPG慢性注射导致H2S生成减少，内皮功能受损，主动脉内皮依赖性舒张功能变差，p-eNOS表达降低，TXNIP表达增加，与CSE-/-小鼠主动脉中蛋白变化趋势一致。
6.PPG促进人脐静脉内皮细胞TXNIP表达，抑制p-eNOS表达。
第二部分：MAPK/TXNIP通路介导内源性硫化氢减少导致的内皮细胞损伤
目的：研究证实内源性硫化氢减少通过MAPK/TXNIP通路导致内皮细胞损伤
方法：选用人脐静脉内皮细胞，将其分为Control组，PPG组，PPG+SB203580组(p38MAPK阻断剂)，PPG+PD98059组(ERKMAPK阻断剂)，PPG+SP600125(JNKMAPK阻断剂)，PPG+SB203580+PD98059+SP600125组，PPG+NaHS组，观察不同组中TXNIP和p-eNOS表达；使用TXNIPsiRNA处理人脐静脉内皮细胞，将其分为：Control组，ScramblesiRNA1组，ScramblesiRNA2组，TXNIPsiRNA1组，TXNIPsiRNA2组，PPG组，PPG+NaHS组，PPG+TXNIPsiRNA1组，PPG+TXNIPsiRNA2组，观察H2S和TXNIP敲低对细胞对影响；使用TXNIPPlasmid处理细胞，将其分为：Control组，EmptyPlasmid组，TXNIPPlasmid组，TXNIPPlasmid+SB203580组，TXNIPPlasmid+PD98059组，TXNIPPlasmid+SP600125组，TXNIPPlasmid+SB203580+PD98059+SP600125组，TXNIPPlasmid+NaHS组，观察TXNIP过表达对细胞的影响。
结果：
1.CSE-/-小鼠主动脉中MAPK表达增高，p38，ERK，JNK磷酸化增强，然而总p38，ERK，JNK表达并没有改变。
2.使用PPG抑制人脐静脉内皮细胞中硫化氢生成，使得p-p38，p-ERK，p-JNK表达升高，p-p38在PPG处理30min时达到最大效应，p-ERK和p-JNK在PPG处理10min达到最大效应，随后有所下降。
3.p38阻断剂SB203580，ERK阻断剂PD98059或者JNK阻断剂SP600125单独孵育血管均改善CSE-/-小鼠主动脉舒张功能；单独使用一种MAPK阻断剂孵育血管可以部分逆转CSE-/-小鼠主动脉中TXNIP和p-eNOS的表达，但不能恢复至对照组水平，当同时应用这三种阻断剂时，可以完全逆转TXNIP和p-eNOS表达，使其恢复到对照组水平。
4.单独使用一种MAPK阻断剂可以部分降低HUVECs中PPG刺激的TXNIP表达升高和部分升高PPG刺激的p-eNOS表达降低，当同时应用这三种阻断剂或者NaHS孵育细胞时，完全逆转PPG组TXNIP和p-eNOS表达，使其恢复至对照组水平。
5.TXNIPsiRNA抑制TXNIP蛋白表达，升高HUVECs中p-eNOS和Trx水平。
6.TXNIPsiRNA使PPG组TXNIP降低至正常水平，使PPG组p-eNOS和Trx升高至对照组水平，应用TXNIPsiRNA改善了PPG导致的内皮细胞损伤。
7.TXNIP过表达质粒明显升高细胞内TXNIP表达，降低p-eNOS和Trx表达；同时应用MAPK阻断剂如SB203580，PD98059，SP600125或者NaHS，对TXNIP，p-eNOS和Trx表达并无影响。
第三部分：PPARδ/SOCS3通路介导内源性硫化氢减少导致的动脉重构
目的：观察内源性硫化氢生成减少对动脉重构的影响及其信号通路。
方法：选用C57BL/6J12周龄，32只，随机分为四组，Vehicle组，NaHS组，PPG组，PPG+NaHS组。NaHS组接受8周的NaHS腹腔注射；PPG组和PPG+NaHS组接受8周的PPG腹腔注射；PPG+NaHS组在第5周起接受4周的NaHS腹腔注射，观察不同组主动脉的收缩功能和炎症水平；选用大鼠血管平滑肌原代培养，分为：Control组，NaHS组，PPG组，PPG+NaHS组，NaHS+GSK0660(PPARδ阻断剂)组，GSK0660组，PPG+GW501516(PPARδ激动剂)组，GW501516组，观察不同组平滑肌细胞内炎症因子表达和PPARδ，SOCS3，p-STAT3表达。
结果：
1.PPG腹腔注射小鼠主动脉收缩压升高，主动脉主动收缩和被动收缩能力均增强；补充NaHS使血压恢复正常水平，主动脉收缩恢复至对照组水平。
2.硫化氢减少导致血管中膜增厚，胶原蛋白在中膜沉积，collagenⅠ和MMP9蛋白表达升高，补充NaHS逆转上述变化。
3.内源性硫化氢缺乏促使平滑肌细胞由收缩表型向增殖表型转化，PPG组收缩表型蛋白αSMA和p27表达降低，增殖表型蛋白PCNA和CyclinE表达升高，补充H2S后收缩表型蛋白和增殖表型蛋白均恢复至对照组水平。
4.内源性硫化氢减少促使主动脉壁炎症因子TNFα、IL6和IL1β表达升高，外源性补充H2S使其恢复至对照组水平。
5.平滑肌细胞内硫化氢减少导致PPARδ和SOCS3表达降低；p-STAT3表达升高，补充H2S逆转上述变化，单独应用NaHS组中蛋白含量均与对照组一致。
6.平滑肌细胞内源性硫化氢减少导致collagenⅠ和MMP9蛋白表达升高，收缩表型蛋白αSMA，p27表达降低，增殖表型蛋白PCNA，CyclinE表达升高，补充H2S后使上述蛋白表达恢复至对照组水平。
7.平滑肌细胞内源性硫化氢减少使炎症相关蛋白TNFα、IL6和IL1β表达升高，同时应用NaHS可以逆转以上变化；硫化氢减少使PPARδ和SOCS3表达降低，p-STAT3表达升高，补充H2S使其恢复至对照组水平。
8.PPARδ的激活剂GW501516可激活下游的SOCS3蛋白，抑制STAT3的磷酸化；应用PPARδ的阻断剂GSK0660，则抑制SOCS3的表达，激活p-STAT3的表达。单独应用GW501516或NaHS则不引起SOCS3和p-STAT3的变化。
9.GW501516可以改善PPG预处理血管对Phenylephrine的收缩反应，也可以改善血管的被动收缩力，表现为血管对拉伸实验产生的张力减小；对NaHS孵育的血管同时应用GSK0660加剧了血管对Phe的收缩反应，增大血管的被动收缩力。
结论：内源性硫化氢在调控内皮细胞功能和动脉管壁重构中发挥重要作用。一方面，内源性硫化氢通过抑制MAPK/TXNIP通路，降低氧化应激水平，保护内皮细胞功能，维持血压恒定；另一方面，内源性硫化氢通过PPARδ/SOCS3信号通路，降低平滑肌细胞炎症因子表达，调节平滑肌表型和细胞外基质表达，维持血压恒定。上述研究结果为H2S的血管保护作用提供了新的证据，可能为高血压等心血管疾病提供新的治疗靶点和策略。