【摘 要】
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该研究采用含EBV复制子(OriP和EBNA1)的附着体质粒载体表达B结构域缺失(A760aa~1639aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBD),并结合顺式作用元件人β-IFN上游的800bp核基质结合区(IFN-MAR),
【出 处】
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上海第二医科大学 上海交通大学医学院 上海交通大学
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该研究采用含EBV复制子(OriP和EBNA1)的附着体质粒载体表达B结构域缺失(A760aa~1639aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBD),并结合顺式作用元件人β-IFN上游的800bp核基质结合区(IFN-MAR),观察体外真核细胞中hFⅧ的表达.同时以质粒DNA直接肌肉注射与低电压,方波长脉冲电刺激相结合介导hFⅧBD在活体小鼠体内的表达,以探索此hFⅧ表达体系在血友病A基因治疗中应用的可行性,为其进一步的临床应用打下前期研究基础.结果表明:1.该实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-FⅧ-EBVR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在.EB病毒复制子的存在可以使质粒DNA在细胞内获得EGFP和hFⅧ较长时间的稳定表达.2.重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR和pcDNA3-FⅧ-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在.IFN-MAR替代OriP后,仍然可以在细胞内获得EGFP和hFⅧ较长时间的稳定表达.3.缺失760~1639位氨基酸的人FⅧBD蛋白主要以90kDa+80kDa重—轻链异二聚体形式存在,与rhFⅧ和野生型hFⅧ相似.并且具有相似的凝血活性.4.最佳的电脉冲参数为电压100V/cm,波宽60ms,脉冲次数1O次和频率0.75Hz.在此最佳的电脉冲参数条件下,电脉冲介导的基因转移可获得较高的基因表达(提高5262倍),没有严重的毒副反应.5.电脉冲刺激不但可以明显提高hFⅧ基因在小鼠体内的表达2~4倍,而且可以获得小鼠体内治疗水平人FⅧ的表达持续至少90天.6.EBV复制子可以使人FⅧ基因在小鼠体内获得更为高效持续的表达,而IFN-MAR可以替代EBV复制子中OriP的复制起始和防止质粒DNA丢失的功能.
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