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编程性翻译移码是mRNA翻译为多肽链时核糖体沿mRNA正向或反向滑动一个/两个碱基从而表达出蛋白的现象。目前为止,编程性翻译移码在多种病毒基因组、原生动物、酵母、鼠、人中均有报道。单细胞真核生物游仆虫基因组中含有的编程性翻译移码基因远远高于其他真核生物基因组。通过对游仆虫属已知的67个基因的分析,推测游仆虫中>5％的基因需要发生一个或多个+1位的翻译移码以产生它们的蛋白产物。影响编程性翻译移码的因素有多种,如肽链释放因子、SD相似序列、假结或茎环结构、tRNA等。研究报道人的肽链释放因子eRF1对HIV-1病毒的编程性-1移码有直接的影响,而且在频繁发生编程性+1移码的单细胞真核生物游仆虫中,肽链释放因子eRF1对编程性翻译移码也有明显的影响。 为了进一步研究eRF1中影响编程性翻译移码的关键序列及调控机理,本研究构建了在酵母中研究编程性翻译移码的双荧光素酶报告检测体系,利用游仆虫肽链释放因子Eo-eRF1b的N结构域和酵母肽链释放因子Sc eRF1的MC结构域构建了杂合肽链释放因子(Eo/Sc eRF1)及其突变体,检测Eo-eRF1b的 N结构域中的不同突变位点对移码效率的影响。获得以下主要结果: 1、首先将含有不同终止密码子(UAA/UAG/UGA)的由七个核苷酸组成的移码序列插入双荧光素酶报告基因中,构建了6个报告基因重组质粒(pDB722A-pDB722F),同时从酵母菌株YDB447/pDB967/pDB722中筛选得到含gal启动子调控的 eRF1的质粒 pDB967,利用质粒洗牌技术成功筛选获得酵母菌株YDB447/pDB967,通过检测不同eRF1水平下移码序列的移码效率,确定本研究成功建立了在酵母中研究编程性翻译移码的双荧光素酶报告检测体系。 2、利用游仆虫肽链释放因子Eo-eRF1b的N结构域和酵母肽链释放因子Sc eRF1的MC结构域构建了杂合肽链释放因子(Eo/Sc eRF1b),以pDB722A-pDB722F6个双荧光素酶重组质粒为报告基因,检测Eo-eRF1b N结构域中的不同突变位点对七个核苷酸组成的移码序列的移码效率的影响。结果发现Eo/Sc eRF1b GT/SR突变体可以显著提高含UAA/UAG移码序列的移码效率,说明eRF1保守的GT区对移码效率有明显的影响,当Eo/Sc eRF1b突变体对UAA/UAG的识别增强时,可以降低含相应终止密码子的移码序列的移码效率。另外,含I126L的组合突变体存在时,含终止密码子UAA/UAG移码序列的移码效率都降低了,这说明,游仆虫中独特的YICDNKF序列可能是通过降低对终止密码UAA/UAG的识别,从而提高了对含有UAA/UAG终止密码子的移码序列AAA-UAR-V(R=A或G)的移码效率。 3、为了探讨在双荧光素酶中间插入大于1000 bp的移码基因后能否利用该体系研究翻译移码,我们将已报道的游仆虫移码基因Ndr2插入到双荧光素酶的中间,构建了pDB722-Ndr2和pDB722-Ndr2-211报告基因重组质粒,检测不同的杂合eRF1突变体对移码基因Ndr2移码效率的影响。结果表明,杂合肽链释放因子Eo/Sc eRF1能够有效的提高移码基因Ndr2的移码效率。当Eo/Sc eRF1b突变体对终止密码子UAA的识别增强时,能够降低移码基因Ndr2的移码效率。 本研究结果提示,游仆虫肽链释放因子YCF区对终止密码子UAA/UAG识别的降低可能是这种生物中发生编程性移码频率较高的原因之一,为探讨纤毛虫编程性翻译移码的调控机制提供了实验数据。