论文部分内容阅读
高血压在世界范围内具有很高的发病率和死亡率,被认为是中风、冠心病和慢性肾病的主要危险因素。尽管越来越多的高血压致病因子被发现,但高血压的发病机制仍不十分明确。大量的研究表明,内皮功能障碍与高血压的发生发展密切相关,其被认为是高血压微血管和大血管并发症发生发展的先兆。此外,内皮功能障碍也被认为是心脏和肾脏等高血压靶器官功能失调的主要因素。内皮细胞功能障碍主要表现为通透性的改变和血管舒张功能受损,与衰老,凋亡,一氧化氮的生成和自噬等生理病理过程密切相关。由于内皮细胞自身修复和再生的能力十分有限,因此,内皮功能已成为高血压及其并发症的重要预后指标之一。因此,寻找对内皮细胞具有保护作用的靶点,对改善内皮细胞损伤,诊断和治疗高血压及其并发症具有十分重要的意义。最新的研究表明表观遗传调控在高血压的发生发展中起着至关重要的作用。其中,组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)所介导的乙酰化修饰在心血管疾病的病理生理过程中的作用越来越引起人们广泛的关注。SIRT6是高度保守的NAD+依赖型的第Ⅲ类HDACs(sirtuin)家族成员之一,其被认为是调控基因组稳定的关键因子之一,并与衰老和代谢性疾病密切相关。最近有研究表明,SIRT6可明显降低心肌重构和动脉粥样硬化的发生发展。然而,SIRT6在高血压及其并发症中的作用和机制尚不清楚。因此,阐明SIRT6在高血压及内皮细胞中的作用和调控机制,为寻找高血压及其并发症的潜在治疗靶点提供理论基础并具有重要的临床意义。研究目的1.明确SIRT6在高血压中的表达平变化及是否参与高血压及相关心肾损伤的发生发展。2.明确内皮细胞SIRT6在高血压及其相关心肾损伤中的作用。3.探讨内皮细胞SIRT6在保护高血压及其相关心肾损伤中的作用机制。研究方法第一部分SIRT6在不同高血压模型小鼠中的表达变化1.1两种不同高血压小鼠模型的构建DOCA/salt引起的高血压小鼠模型:取12周雄性野生(wild type,WTT)C57BL/6小鼠,摘取单肾恢复一周后,在其肩胛皮下植入21天醋酸脱氧皮质酮(deoxycorticosterone acetate,DOCA)缓释片,并将其饮用水换成1%盐水,21天后收取样本。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)引起的高血压小鼠模型:取12周雄性WT小鼠,将制作好的AngⅡ缓释泵(1000ng/kg/min)植入到小鼠背部皮下,28天后收取样本。1.2 SIRT6在高血压小鼠心脏,肾脏和血管中表达变化通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)分别检测DOCA/salt以及AngⅡ引起的高血压小鼠的心,肾以及血管中SIRT6蛋白水平的表达情况。1.3 SIRT6在主动脉及肾小球内皮细胞中的表达情况利用免疫荧光(immunoflourescence,IF)双标法确定高血压小鼠肾小球内皮细胞以及主动脉内皮细胞中SIRT6的表达变化。1.4高血压肾病病人肾活检标本肾小球中SIRT6的表达情况通过免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测高血压肾病病人肾活检标本肾小球中SIRT6的表达变化。1.5不同高血压致病因子刺激内皮细胞后SIRT6的表达变化在体外,利用WB检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,10-6mol/L,48h),内皮素1(ET-1,1 00nmol/L,48h)以及过氧化氢(H2O2,200μmol/L,24h)刺激后大鼠肾小球内皮细胞(rat glomerular endothelial cells,RGECs),人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),人肾小球内皮细胞(human glomerular endothelia cells,HGECs)和大鼠主动脉内皮细胞(rat aortic endothelial cells,RAECs)中 SIRT6蛋白水平的表达变化。第二部分内皮细胞SIRT6在高血压及其心肾损伤中的作用2.1内皮特异性SIRT6敲除小鼠的构建以及表型通过Cre-Loxp系统构建内皮特异性SIRT6敲除小鼠,并通过PCR对提取的鼠尾DNA进行小鼠基因型鉴定。通过WB检测不同组小鼠肾小球,血管以及心脏中SIRT6的蛋白水平,对SIRT6敲除效率进行评估。对不同年龄(4月,8月,12月)野生型和敲基因小鼠的收缩压,舒张压和平均血压进行测量并统计分析。2.2内皮特异性SIRT6敲除对小鼠血压的影响对不同组小鼠的收缩压,舒张压以及平均血压进行测量和统计分析。2.3内皮特异性SIRT6敲除对小鼠内皮功能的影响将小鼠二级肠系膜阻力动脉(内径150-300μm)分离并进行血管环实验,通过不同组小鼠肠系膜阻力动脉对乙酰胆碱(有或无L-NAME预处理,L-nitro arginine methyl ester)和硝普钠的反应性来评估内皮舒张功能。通过透射电镜的方法观察不同组小鼠肾小球内皮细胞的结构变化。2.4内皮特异性SIRT6敲除对小鼠肾功能的影响通过肾重体重比以及蛋白尿水平(urine albumin-to-creatinine ratio,UACR)来评估不同组小鼠的肾功能。通过过碘酸雪夫氏(periodic acid Schiff,PAS)染色评估肾小球系膜增生。2.5内皮特异性SIRT6敲除对小鼠心血管功能的影响利用超声心动图(echocardiography)测量小鼠收缩末和舒张末期室间隔厚度(interventricular septal dimension,IVS),左心室内径(left ventricular internal dimension,LVID),左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW),射血分数(ejection fraction,EF)以及左心室短轴缩短率(fraction shortening,FS)来评估不同组小鼠的心脏功能和心肌重构。通过苏木素伊红(hematoxylin-eosin staining,H&E)染色评估不同组小鼠心肌重构和血管重构。利用masson三色染色对不同组小鼠心脏中血管周围纤维化程度进行观察。2.6体外条件下研究SIRT6对内皮细胞功能的作用利用腺病毒转染内皮细胞,实现内皮细胞中SIRT6过表达。通过Transwell实验来检测不同处理组内皮细胞通透性的改变,进一步利用WB检测内皮通透性相关蛋白ZO-1,MMP2和MMP9在不同处理下的表达变化。通过WB检测衰老相关蛋白P16和P21在不同处理下的表达变化以及β-半乳糖苷酶染色来研究SIRT6对内皮细胞衰老的影响。利用WB,Tandem以及透射电镜三种方法观察SIRT6对内皮细胞自噬的影响。为了进一步明确SIRT6介导的自噬流对内皮功能的影响,我们加入自噬抑制剂3-MA。利用流式细胞术和caspase-3活性检测来明确SIRT6介导的自噬对内皮细胞凋亡的影响。通过JC-1染色来检测SIRT6介导的自噬对内皮细胞线粒体功能的作用。通过荧光定量PCR检测内皮相关炎性因子的mRNA水平。β-半乳糖苷酶染色检测自噬对内皮细胞衰老的影响。最后利用格里斯试剂来检测一氧化氮的生成来进一步明确SIRT6介导的自噬对内皮功能的作用。第三部分SIRT6改善高血压致内皮功能损伤的分子机制3.1 SIRT6对其特异性底物H3K9和H3K56位点的乙酰化水平的调控通过WB检测不同组小鼠分离的肾小球中乙酰化的H3K9(H3K9ac)和H3K56(H3K56ac)蛋白水平,进一步通过免疫荧光双标观察不同组小鼠肾小球内皮细胞中H3K9ac的水平。此外,利用通过免疫组化检测高血压肾病病人肾活检标本肾小球中H3K9ac的表达情况。3.2 SIRT6对高血压相关转录因子GATA5的调控WB检测显示不同组小鼠肾小球中GATA5蛋白水平,进而通过免疫荧光双标观察不同组小鼠肾小球内皮细胞中GATA5水平。采用蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)来检测SIRT6与GATA5是否具有直接相互作用。通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)的方法来探索H3K9ac和H3K56ac是否与GATA5启动子有结合且在不同处理组中结合是否发生变化。3.3 SIRT6对转录抑制因子Nkx3.2的调控首先,在体外通过WB验证SIRT6对H3K9ac和GATA5的调控,同时利用ChIP实验来检测H3K9ac和H3K56ac与GATA5启动子的结合在不同处理下是否发生变化。通过WB检测SIRT6对转录抑制因子Nkx3.2在不同处理下的调控。利用Co-IP的方法来检测SIRT6与Nkx3.2是否具有直接相互作用。然后采用ChIP实验来探索H3K9ac和H3K56ac是否与Nkx3.2启动子有结合且在不同处理下结合是否发生变化,并在体内分离的肾小球中进行验证。最后利用小干扰RNA沉默SIRT6和Nkx3.2来验证SIRT6,GATA5和Nkx3.2三者之间相互作用关系。通过观察不同处理组内皮细胞通透性改变和NO产生来验证此通路的作用。3.4体内过表达SIRT6对高血压及相关的心肾损伤的作用通过慢病毒转染实现小鼠体内SIRT6高表达。采用尾套法对不同组小鼠的收缩压,舒张压以及平均血压进行测量和统计分析,来检测过表达SIRT6是否对小鼠血压起到改善作用。然后利用血管环实验观察过表达SIRT6是否对小鼠内皮功能有改善作用。通过测量UACR,PAS染色和透射电镜来检测过表达SIRT6是否对小鼠肾功能发挥改善作用。最后利用超声心动图,H&E染色和masson染色来评估过表达SIRT6是否对小鼠心血管功能产生改善作用。研究结果:第一部分SIRT6在不同高血压模型小鼠中的表达变化1.1两种不同高血压小鼠模型构建的评价DOCA/salt引起的高血压小鼠模型与AngⅡ引起的高血压小鼠模型均在造模周期结束时进行血压测量,血压大于140mmHg认为造模成功,所有高血压小鼠均达到造模成功标准。1.2 SIRT6在两种高血压小鼠心脏,肾脏以及血管中表达明显降低通过WB检测发现,与对照组相比,SIRT6的蛋白表达水平在DOCA/salt以及Ang Ⅱ引起的高血压小鼠的心脏,肾脏以及血管中均显著降低。1.3 SIRT6在肾小球内皮细胞和主动脉内皮细胞中表达下调利用免疫荧光双标法证明,与对照组相比,SIRT6的表达水平在DOCA/salt和Ang Ⅱ引起的高血压小鼠肾小球内皮细胞以及主动脉内皮细胞中均明显下调。1.4 SIRT6的表达在高血压肾病病人肾活检标本肾小球中显著下调通过免疫组化发现,高血压肾病病人肾活检标本肾小球中SIRT6的表达与对照组相比显著下调。1.5在不同高血压致病因子刺激四种内皮细胞后SIRT6的蛋白水平均呈现不同程度的降低通过 WB 检测发现,Ang Ⅱ、ET-1 以及 H2O2 刺激后,RGECs、HUVECs、HGECs和RAECs中SIRT6的蛋白水平均呈现不同程度的降低。第二部分内皮细胞SIRT6在高血压及其心肾损伤中的作用2.1内皮特异性SIRT6敲除小鼠的构建以及表型通过琼脂糖凝胶电泳对提取的鼠尾DNA进行小鼠基因型鉴定确认内皮细胞特异敲除SIRT6小鼠构建成功。WB进一步确认,SIRT6蛋白水平在内皮特异SIRT6敲除小鼠的肾小球,血管以及心脏中明显降低。通过尾套法对不同年龄(4月,8月,12月)野生型和敲基因小鼠的收缩压,舒张压和平均血压进行测量发现,与年龄匹配的对照组相比,8月和12月年龄的内皮特异SIRT6敲除小鼠的血压有明显的升高。2.2内皮特异性SIRT6敲除加重了小鼠血压的升高通过尾套法对不同组小鼠的收缩压,舒张压以及平均血压进行测量和统计分析发现,内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压小鼠血压的升高。2.3内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压对小鼠内皮功能的损伤将肠系膜二级阻力动脉(内径150-300μm)分离进行血管环实验,发现内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压小鼠内皮功能的损伤。透射电镜观察到内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的肾小球内皮细胞窗孔数量的降低。2.4内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压对小鼠肾功能的损伤内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的肾重体重比以及UACR的升高。PAS染色表明内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的肾小球系膜增生。2.5内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的小鼠的心功能紊乱超声心动图结果显示内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的心肌肥厚型重构以及心脏功能紊乱,H&E染色进一步发现内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的小鼠心肌重构和血管重构。Masson三色染色发现内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的小鼠心脏中血管周围的纤维化。2.6体外实验证明SIRT6对内皮细胞功能发挥保护作用WB证实通过腺病毒转染实现内皮细胞中SIRT6过表达。Transwell,WB及免疫荧光结果表明SIRT6可以显著改善内皮细胞的通透性。WB及β-半乳糖苷酶染色结果表明SIRT6能够明显减少内皮细胞衰老。WB,Tandem以及透射电镜结果显示SIRT6能够促进内皮细胞自噬。流式和caspase-3活性检测结果表明SIRT6能通过促进内皮细胞自噬来抑制凋亡。JC-1染色结果显示SIRT6能通过促进自噬改善内皮细胞线粒体功能。荧光定量PCR结果表明SIRT6能降低内皮相关炎性因子的mRNA水平。β-半乳糖苷酶染色显示SIRT6能通过促进自噬减少内皮细胞衰老。通过格里斯试剂检测发现SIRT6能够促进一氧化氮的生成。第三部分SIRT6改善高血压致内皮功能损伤的分子机制3.1 SIRT6对H3K9和H3K56的乙酰化水平的调控WB实验表明内皮特异性SIRT6敲除进一步促进了高血压引起肾小球中H3K9ac蛋白水平的升高,而H3K56ac水平在不同处理组的肾小球中变化不大。免疫荧光双标证明内皮特异性SIRT6敲除促进了高血压引起的肾小球内皮细胞中H3K9ac表达水平的升高。免疫组化结果显示高血压肾病病人肾活检标本肾小球中H3K9ac的表达较对照组明显升高。3.2 SIRT6非直接调控GATA5WB检测显示内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起肾小球中GATA5蛋白水平的下调,进而通过免疫荧光双标证明内皮特异性SIRT6敲除加重了高血压引起的肾小球内皮细胞中GATA5蛋白水平的下调。Co-IP实验证实SIRT6与GATA5没有直接的相互作用。通过ChIP实验我们发现虽然H3K9ac和H3K56ac与GATA5启动子有结合,但在不同处理下SIRT6对其结合能力不产生影响。3.3 SIRT6通过去乙酰化组蛋白H3K9来抑制Nkx3.2的转录最终促进GATA5的表达在体外,通过WB检测SIRT6对H3K9ac和GATA5的调控以及利用ChIP实验来检测H3K9ac和H3K56ac与GATA5启动子的结合,结果与体内一致。WB结果表明SIRT6负调控转录抑制因子Nkx3.2的表达水平。Co-IP结果显示SIRT6与Nkx3.2没有直接相互作用。ChIP实验发现H3K9ac和H3K56ac与Nkx3.2启动子有结合且只有H3K9ac与Nkx3.2启动子的结合受SIRT6的调控,相同结果在体内分离的肾小球中得到验证。利用小干扰RNA沉默SIRT6和Nkx3.2验证了 SIRT6,GATA5和Nkx3.2三者之间作用关系。最后验证了 SIRT6通过调控Nkx3.2-GATA5通路来改善内皮细胞通透性及促进NO产生。3.4体内过表达SIRT 6可减轻高血压及相关的心肾损伤。首先,通过Real-time RT-PCR证实SIRT6体内高表达成功。通过尾套法对血压进行测量和统计分析发现过表达SIRT6改善小鼠高血压。利用血管环实验证明过表达SIRT6改善高血压小鼠内皮功能。然后通过检测UACR,PAS染色和透射电镜发现过表达SIRT6改善高血压小鼠肾功能。最后通过超声心动图,H&E染色和masson染色观察到过表达SIRT6改善高血压小鼠心血管功能。结论与创新性1.本研究首次证实SIRT6在不同病理生理条件下如DOC A/salt和AngⅡ诱导的高血压模型小鼠中的心脏、肾脏和血管中表达明显下调。特别是,进一步发现内皮细胞特异性SIRT6敲除加剧了 DOCA/salt和AngⅡ诱导的高血压,内皮功能障碍和心肾损伤。2.本研究明确了 SIRT6通过促进一氧化氮生成,改善内皮细胞通透性,降低内皮衰老和凋亡,以及促进自噬来对内皮细胞起到保护作用。在分子机制上,首次证明SIRT6通过靶向调控的Nkx3.2-GATA5信号通路是调节内皮功能的关键信号转导途径之一,该研究为进一步阐述SIRT6的生物学功能,并且为寻找高血压治疗策略的新靶点提供了重要实验基础和理论依据。