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粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea,异名:粉红粘帚霉:Gliocladum rosea)是一种重要的植物寄生线虫天敌真菌,能够寄生线虫的卵、幼虫和成虫,是研究植物病害生防菌剂的主要研究材料之一。
本研究以粉红螺旋聚孢霉高效侵染菌株YMF1.00611为出发菌株,以侵染线虫过程中的毒力因子胞外丝氨酸蛋白酶PrC为研究对象,研究逆境信号对PrC的作用。
论文主要的研究结果和结论如下:
1.在逆境条件下(包括过氧化氢、维生素K及热激),胞外丝氨酸蛋白酶PrC的mRNA水平显著升高。
2.在PrC启动子上含有一个逆境反应元件5’-AAGGGG-3’(stress responseelement,STRE)。构建含有5’-AAGGGG-3’序列的启动子片段-葡萄糖氧化酶goxA报告基因的质粒pSJ4中,转化到粉红螺旋聚孢霉原生质体内,结果证明PrC启动子上的5,-AAGGGG-3’区域在逆境条件上调PrC表达中起作用,表明该调节发生在转录水平上。
3.食线虫真菌粉红螺旋聚胞霉分泌的PrC可降解线虫体壁,为自身获得营养。为了研究PrC在逆境条件下表达上调的生物学意义,本文测定了线虫体壁对粉红螺旋聚孢霉在逆境条件下的生长和孢子萌发的影响。结果发现,经过氧化剂过氧化氢(0.25 mM)、维生素K(0.08 mg/ml)和37℃热激处理的孢子生长速度较正常对照组慢。但是,加入线虫后能够部分解除这些逆境条件对真菌生长抑制的影响。
4.我们还研究线虫体壁对逆境条件诱导的粉红螺旋聚孢霉细胞死亡的影响。结果发现,高浓度氧化剂过氧化氢(2.5 mM)、维生素K(0.8 mg/ml)和42℃热激处理导致粉红螺旋聚孢霉死亡。但是加入线虫后,能够显著抑制这些逆境条件诱导真菌死亡。
5.为了进一步研究线虫存在对逆境条件诱导的细胞死亡的保护机制,我们测定细胞内的活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)。结果表明用过氧化氢、维生素K和热激处理的孢子可以观察到大量绿色荧光,表明细胞内产生大量ROS。而在线虫的存在下,过氧化氢和维生素K处理诱导的绿色荧光产生显著地降低。我们推测,PrC降解线虫体壁的产物,进入细胞后能抑制逆境诱导的ROS产生;或降解产物进入细胞后可能诱导其它反应产生抗氧化、热激等逆境,抗细胞死亡的信号。
本论文的创新性主要体现在以下的几个方面:
1.首次报道了氧化应激及热激上调食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因表达。
2.首次发现线虫体壁抑制氧化应激及热激诱导的食线虫真菌生长停滞和细胞死亡,其机制可能与上调PrC基因表达有关。