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血管内支架植入术在临床上的应用越来越广泛。虽然支架可以降低球囊扩张术（PTA）后因血管壁回缩和重塑形造成的再狭窄发生率，临床上随访效果仍然不尽理想，据统计有20-30％的病例发生再狭窄，其中50％发生于手术后1年内。其发生机理包括：其发病机理包括：（1）血管损伤，包括免疫反应损伤、手术操作损伤及血管壁的缺血再灌注损伤等；（2）血栓形成及内膜增生，多种生长因子被激活引起内膜增生，造成血管内腔狭窄。其病理变化表现为：①早期血管内皮细胞变性、脱落，内膜下层裸露；②附壁血栓形成、机化；③炎性细胞黏附、浸润；④中层平滑肌细胞增殖，向新生内膜移行，血管内膜增厚。
针对血管内支架植入术后再狭窄的发生机理及组织学改变，防治策略的焦点在于抑制支架植入后损伤修复过度所致的内膜及SMC增生和血栓形成。目前研究的防治方法包括：药物覆盖支架、放射性同位素局部内照射、基因治疗技术和单克隆抗体技术等。其中基因技术为近年来应用于抗血管再狭窄的新技术，现已经确定若干基因表达产物可以有效的防止血管血栓形成和内膜过度增生，并取得了一定的治疗效果。
鉴于血管再狭窄的发生机理的复杂性，单一基因基因治疗往往不能取得满意疗效，多基因的防治措施势必是研究的方向。本课题设想设计一种能够完整表达双基因的新型载体，转染于血管局部并得到正确地基因表达产物，以探讨对血管内支架植入术后血管再狭窄的防治作用。
第一部分 颈动脉植入血管支架建立再狭窄动物模型的研究
以新西兰兔作为实验研究对象，在其颈总动脉处植入用肝素预处理的支架，建立血管内支架植入术后再狭窄动脉模型，并通过电镜及组织学染色观察支架植入术后平滑肌细胞增殖和内膜增生情况。然后，分别利用携带VEGF<,165>（血管内皮生长因子）和eNOS（内皮型一氧化氮合酶）基因的支架植入兔颈总动脉，评估其抑制内膜增生的作用。
结果显示：局部运用肝素可以起到预防支架植入术后早期急性血栓形成。组织学检测显示术后3天，局部附壁血栓形成，平滑肌细胞向合成表型转变，细胞器丰富；术后1周，平滑肌细胞向内膜移行，内膜开始增厚；术后4周，新生内皮出现，内膜进一步增厚；术后12周内皮完全覆盖，内膜／中膜比值进一步增加，管腔狭窄。上述病理变化证明相关动物模型构建成功。分别转染VEGF<,165>和eNOS后，RT-PCR检测显示术后1天出现相关mRNA表达，3-7天达到高峰，4周后下降。免疫组化染色显示VEGF<,165>和eNOS蛋白于术后3天表达，并可以持续至术后4周。组织学检测结果同基因及蛋白的变化密切相关，显示VEGF<,165>和eNOS两组术后血管壁内膜／中膜比值逐渐增加。实验结果证实利用支架携带VEGF和eNOS基因，能够成功的向局部血管壁转染相关基因，并分泌具有生物活性的蛋白。但是实验组的血管壁与其对照组内膜／中膜比值和血管腔面积狭窄率与对照组相比，均没有显著差异。
第二部分pIRES-VEGF<,165>-eNOS双基因表达载体的构建和表达
鉴于单基因治疗抗血管再狭窄的局限性，我们设计构建双基因表达载体。已有研究证明，VEGF能特异性的促进内皮细胞有丝分裂和增殖；NO是一种重要的生物信使分子和效应分子，对抑制血管平滑肌细胞增殖等起着重要作用。利用IRES序列构建了pIRES-VEGF<,165>-eNOS双基因真核表达载体的基础上，阳离子脂质体介导下将其转染原代培养的HCV304细胞（人脐静脉内皮细胞），通过RT-PCR （逆转录反应－聚合酶链式反应）、ELISA（酶联接免疫吸附剂测定）和免疫组化分别检测VEGF mRNA、eNOS mRNA、VEGF蛋白和eNOS蛋白的表达。
实验结果：酶切电泳和核苷酸序列测定证实pIRES-VEGF<,165>-eNOS表达载体构建成功。采用阳离子脂质体介导的基因转染技术，成功将其转入内皮细胞ECV304。RT-PCR显示基因转染后细胞内VEGF mRNA和eNOS mRNA水平显著上升，ELISA显示基因转染2天后培养液上清VEGF蛋白表达显著上升（576.12±65.46 Vs 133.63±6.38 pg/ml，P<0.01）；免疫组化荧光染色显示VEGF和eNOS两种蛋白共同表达，共聚焦显微镜显示两种蛋白同时分别表达于细胞质和细胞膜中符合两种蛋白在细胞中的正常分布。MTT法显示pIRES-VEGF<,165>-eNOS基因后能明显促进内皮细胞的增殖。NOS和NO检测试剂盒检测被转染细胞的eNOS活性和培养液NO含量显著上升。
第三部分 血管腔内应用携带pIRES-VEGF<,165>-eNOS基因支架防治血管再狭窄的实验研究
完整的内皮层能够维持平滑肌细胞的收缩表型，同时有助于防止血栓形成、血小板凝集、降低局部促进平滑肌细胞增殖的生长因子的浓度，抑制平滑肌细胞的增生，从而同时提高了短期和长期的血管术后通畅率。本实验部分将携带有能够同时表达促进内皮细胞分裂增殖的VEGF<,165>基因和表达产生NO的人eNOS基因的双基因真核表达载体的支架植入血管腔，运用RT-PCR及免疫组化方法分别检测VEGF mRNA、eNOS mRNA、c-myc mRNA、VEGF蛋白和eNOS蛋白的表达，以判断是否成功转染并表达相应功能蛋白；通过扫描电镜检测VEGF对移植血管内皮细胞生长作用和NO对平滑肌细胞生长表型的影响；并通过组织学检测评价双基因对血管支架植入后再狭窄的干预作用。
结果显示：实验组术后1天就可以见到少量VEGF<,165>mRNA和eNOS mRNA表达，术后3天表达至高峰，维持至术后4周时表达才明显降低；相应VEGF和eNOS蛋白于术后3天即有表达，术后2周达到高峰，术后2个月明显降低；术后3天c-myc mRNA的表达达到高峰，以后表达逐渐降低，在表达强度和高峰时间上实验组与对照组有明显差异。与基因、蛋白表达相对应，扫描电镜显示实验组内皮修复时间较对照组明显提前，术后2周，支架部位血管内皮基本覆盖；而同一时段的实验组平滑肌细胞活跃程度明显较对照组低，其合成表型要明显少于对照组。C-myc mRNA表达趋势和对照组一致，但是高峰值明显低于对照组，两组有显著差异（P<0.05）。在第8、12周时实验组血管内膜增生厚度明显低于对照组。说明了VEGF<,165>和eNOS基因不仅表达良好，而且两种蛋白也发挥了相应功能。证实了这两种基因共表达可以有效地抑制血管再狭窄。