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肌球蛋白的杆状尾部是典型的双链超螺旋结构(coiled coil)，肌球蛋白coiledcoil的结构与功能决定了肌球蛋白在溶液中的溶解性能(或聚集性能)、形成粗丝的能力及肉类蛋白的凝胶特性。目前国内外学者对肌球蛋白coiledcoil的研究主要集中在肌球蛋白coiledcoil的生物学功能方面，而关于肌球蛋白coiledcoil的自组装、解离的分子机制，以及环境条件对coiledcoil、coiledcoil多聚体(多个coiledcoil的聚合体)的三维结构和分子间作用力的影响机理等相关研究却罕有报道。本文以草鱼肌球蛋白coiledcoil为研究对象，分析其氨基酸序列、构建coiledcoil分子模型；采用拉伸动力学手段探究coiledcoil相互堆砌的模式以及肌球蛋白从粗丝结构中解离的动力学过程；用分子动力学模拟的方法考察环境条件对coiledcoil及其多聚体结构的影响以及NaCl离子在肌原纤维模拟结构中的扩散特性。本研究将有助于深入了解鱼肉类制品在加工和储藏过程中肌球蛋白结构与功能发生变化的分子机理，为鱼肉产品的品质控制奠定新的理论依据。主要研究结果如下：
1Coiledcoil的氨基酸序列及其分子结构
草鱼肌球蛋白尾部S2(Myosin subfragment 2，S2)和LMM(Light meromyosin， LMM)片段与鲢鱼、鲤鱼、鳜鱼、罗非鱼及黄花鱼的相关氨基酸序列具有较高的同源性，相似性超过90%。S2和LMM片段的氨基酸序列形成coiledcoil的概率几乎达到100%，但在序列中出现了4处间隔点(skip)。氨基酸序列中的skip残基在一定程度上增加了肌球蛋白杆部的“柔性”，使得LMM片段的弯曲自由度要高于S2片段，有利于肌原纤维粗丝中的肌球蛋白的柔性堆砌。在coiledcoil疏水核心区域(a、d位置)分布的疏水性氨基酸占疏水性氨基酸总数的60.4%，coiledcoil分子表面(b-c、e-f-g位置)则主要分布着极性氨基酸残基，草鱼肌球蛋白S2和LMM片段至少在氨基酸组成上差异不大。采用最小二乘支持向量机预测模型的混合建模方法(Least Squares Support Vector Machine Hybrid Modeling，LSSVM-HM)构建的草鱼肌球蛋白coiledcoil三维结构具有较高的可靠性。与其他建模方法相比，LSSVM-HM方法构建的coiledcoil结构在拉曼构象分析、残基侧链局部势能分布及Qmean6z-score等结构评估方法下表现更佳。通过与已经解析的同源蛋白晶体结构的三维空间比对验证，LSSVM-HM构建的coiledcoil主链和侧链的准确性明显具有一定的优势。
本文构建的coiledcoil结构共有1099个残基，其中S2片段的超螺旋半径为5.17?，每圈超螺旋含有99个残基，螺距为13.3nm，alpha-螺旋链的夹角为25.2°，而LMM片段的超螺旋半径为4.89?，每圈超螺旋含有103个残基，螺距为14.8nm，alpha-螺旋链的夹角为22.4°，表现出S2片段“粗而短”，LMM片段“细而长”的形貌特征。S2和LMM片段的alpha-螺旋链的结构参数无明显的差异，alpha-螺旋链每圈含有的残基数量为3.53个、每个残基在主轴方向的增量为0.14nm以及alpha-螺旋链的半径平均值则为2.25?。
2Coiledcoil的堆砌模式及其解离的分子机制
采用拉伸动力学手段研究coiledcoil分子间的作用力及其堆砌模式、以及不同环境条件下coiledcoil从多聚体结构中解离的动力学过程。Coiledcoil分子间接触面的电荷差异性与分子间相对转角密切相关，coiledcoil在旋转一圈(0o~360o)的范围内等间距存在6个电荷差异峰值，静电相互作用是形成和稳定粗丝结构的主要的作用力。当相对转角为60o倍数时，coiledcoil二聚体分子间静电作用力最大，结构最稳定，此时coiledcoil分子间的轴向错位约有18个氨基酸残基。肌原纤维粗丝结构中coiledcoil的堆砌模式为：处于中心位置的coiledcoil与附近六个呈等六边形排列的coiledcoil相互平行堆砌，堆砌间距为2nm，coiledcoil分子间相对转角为60o倍数且彼此轴向错位约18个残基。用拉伸动力学方法将七聚体结构中心的coiledcoil分子沿着其它coiledcoil所形成的环形通道逐渐拉离七聚体，以模拟肌球蛋白从肌原纤维粗丝中解离的过程。温度、NaCl浓度及H+/OH-浓度(ConcentrationofH+orOH-，Cab)等环境条件对移动coiledcoil所受到的轴向拉伸应力和拉伸势能有显著影响。移动coiledcoil所受到的拉伸应力和拉伸势能随着温度的升高而降低。NaCl浓度为0.5M及H+/OH-浓度为5.0时(T=300K)，移动coiledcoil所受到的拉伸应力(＜600KJ?mol-1?nm-1)和拉伸势能(0.78?105KJ/mol)达到最小，其它的NaCl浓度和H+/OH-浓度将使得移动coiledcoil所受到的拉伸应力和拉伸势能变大。更高的温度(280K~340K)，适宜的NaCl浓度(0.5M)和H+/OH-浓度(5.0)将有利于肌球蛋白从粗丝结构中解离出来。
3环境条件对coiledcoil及其多聚体结构参数及溶剂化能力的影响
采用分子模拟的方法研究了温度、NaCl浓度及H+/OH-浓度等环境条件对模拟体系中coiledcoil和coiledcoil七聚体的结构参数及溶剂化能力的影响。随着温度升高coiledcoil结构的收缩程度变大，而七聚体则发生了明显的膨胀，较高温度(＞320K)导致七聚体构象变化，处于不稳定状态，320K是coiledcoil及其七聚体构象改变的起始温度。温度为300K(26.8℃)时，coiledcoil及其七聚体的溶剂化自由能最大，在水中处于最稳定状态。升高温度将削弱氢键和离子键作用，导致coiledcoil及其七聚体与水分子的溶剂化作用呈下降趋势；随着NaCl浓度增加，水溶液中coiledcoil分子结构的收缩程度变大。而七聚体的结构在低盐条件(＜0.2M)下有小幅度的收缩，较高盐浓度下(0.4M~0.8M)七聚体结构存在明显的膨胀。极高NaCl浓度(＞0.8M)下，coiledcoil及其七聚体结构发生了盐致构象变化，coiledcoil结构产生剧烈的收缩，而七聚体结构在模拟过程中coiledcoil的有序堆砌模式遭到了破坏。低盐环境下coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化能力较弱，NaCl浓度为0.2M时，coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化自由能最小，coiledcoil及其多聚体在水溶液中的稳定性差容易相互聚集。而在较高盐浓度下，提高NaCl浓度能够明显的增加coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化自由能，在不导致盐致构象变化的情况下，0.6M左右的NaCl浓度是coiledcoil单体存在于溶液中或是coiledcoil多聚体解离的最佳离子环境；H+/OH-浓度7.0时coiledcoil及其七聚体结构较为稳定，H+/OH-浓度远离中性时coiledcoil及其七聚体均出现明显的先收缩而后膨胀的现象，极酸或极碱可能破坏了蛋白分子内的离子键和氢键，使得蛋白结构不可逆的构象变化。H+/OH-浓度5.0时coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化自由能最小，H+/OH-浓度5.0为草鱼肌球蛋白coiledcoil的等电点，coiledcoil及其七聚体结构最终的收缩幅度最大。随着溶液酸碱环境偏离pI5.0，分子的溶剂化自由能呈逐渐增加的趋势，coiledcoil及其七聚体在偏酸性或碱性的溶液中也更加稳定。
4NaCl离子在肌原纤维蛋白中的扩散特性
采用分子动力学模拟的方法研究NaCl离子在肌原纤维模拟结构中的扩散特性。NaCl离子与coiledcoil带电残基的静电相互作用是其扩散迁移的主要阻力。模拟实验中NaCl离子使得肌原纤维模拟结构发生了膨胀，coiledcoil分子间隙变大，盐离子与带电残基的静电作用力降低。Fick第二定律的双边平板模型能够很好的用来描述NaCl在肌原纤维模拟结构中的扩散分布。垂直于肌原纤维和平行于肌原纤维两个方向上，NaCl的扩散存在异向性。垂直于肌原纤维和平行于肌原纤维方向的NaCl扩散系数Dx和Dy均随着模拟时间的延长呈现下降趋势，随着温度升高，Dx和Dy的值增大。NaCl的扩散系数Dy(16.7×10-9~120×10-9m2/s)值大于Dx(2.91×10-9~88.8×10-9m2/s)。改进型Arrhenius方程能够极好的拟合NaCl扩散系数Dx或Dy与温度及模拟时间的关系，NaCl的垂直方向扩散活化能(6.144 KJ/mol)要大于平行方向扩散活化能(5.510 KJ/mol)，表明NaCl在垂直于肌原纤维方向扩散比在平行于肌原纤维方向扩散需要消耗更多的能量。草鱼片腌渍实验计算出的NaCl扩散系数和扩散活化能与本文模拟实验的结果基本一致，研究表明，采用分子动力学与实验相结合的方法确定NaCl在肌原纤维蛋白中的扩散系数和扩散活化能具有较高的准确性。
1Coiledcoil的氨基酸序列及其分子结构
草鱼肌球蛋白尾部S2(Myosin subfragment 2，S2)和LMM(Light meromyosin， LMM)片段与鲢鱼、鲤鱼、鳜鱼、罗非鱼及黄花鱼的相关氨基酸序列具有较高的同源性，相似性超过90%。S2和LMM片段的氨基酸序列形成coiledcoil的概率几乎达到100%，但在序列中出现了4处间隔点(skip)。氨基酸序列中的skip残基在一定程度上增加了肌球蛋白杆部的“柔性”，使得LMM片段的弯曲自由度要高于S2片段，有利于肌原纤维粗丝中的肌球蛋白的柔性堆砌。在coiledcoil疏水核心区域(a、d位置)分布的疏水性氨基酸占疏水性氨基酸总数的60.4%，coiledcoil分子表面(b-c、e-f-g位置)则主要分布着极性氨基酸残基，草鱼肌球蛋白S2和LMM片段至少在氨基酸组成上差异不大。采用最小二乘支持向量机预测模型的混合建模方法(Least Squares Support Vector Machine Hybrid Modeling，LSSVM-HM)构建的草鱼肌球蛋白coiledcoil三维结构具有较高的可靠性。与其他建模方法相比，LSSVM-HM方法构建的coiledcoil结构在拉曼构象分析、残基侧链局部势能分布及Qmean6z-score等结构评估方法下表现更佳。通过与已经解析的同源蛋白晶体结构的三维空间比对验证，LSSVM-HM构建的coiledcoil主链和侧链的准确性明显具有一定的优势。
本文构建的coiledcoil结构共有1099个残基，其中S2片段的超螺旋半径为5.17?，每圈超螺旋含有99个残基，螺距为13.3nm，alpha-螺旋链的夹角为25.2°，而LMM片段的超螺旋半径为4.89?，每圈超螺旋含有103个残基，螺距为14.8nm，alpha-螺旋链的夹角为22.4°，表现出S2片段“粗而短”，LMM片段“细而长”的形貌特征。S2和LMM片段的alpha-螺旋链的结构参数无明显的差异，alpha-螺旋链每圈含有的残基数量为3.53个、每个残基在主轴方向的增量为0.14nm以及alpha-螺旋链的半径平均值则为2.25?。
2Coiledcoil的堆砌模式及其解离的分子机制
采用拉伸动力学手段研究coiledcoil分子间的作用力及其堆砌模式、以及不同环境条件下coiledcoil从多聚体结构中解离的动力学过程。Coiledcoil分子间接触面的电荷差异性与分子间相对转角密切相关，coiledcoil在旋转一圈(0o~360o)的范围内等间距存在6个电荷差异峰值，静电相互作用是形成和稳定粗丝结构的主要的作用力。当相对转角为60o倍数时，coiledcoil二聚体分子间静电作用力最大，结构最稳定，此时coiledcoil分子间的轴向错位约有18个氨基酸残基。肌原纤维粗丝结构中coiledcoil的堆砌模式为：处于中心位置的coiledcoil与附近六个呈等六边形排列的coiledcoil相互平行堆砌，堆砌间距为2nm，coiledcoil分子间相对转角为60o倍数且彼此轴向错位约18个残基。用拉伸动力学方法将七聚体结构中心的coiledcoil分子沿着其它coiledcoil所形成的环形通道逐渐拉离七聚体，以模拟肌球蛋白从肌原纤维粗丝中解离的过程。温度、NaCl浓度及H+/OH-浓度(ConcentrationofH+orOH-，Cab)等环境条件对移动coiledcoil所受到的轴向拉伸应力和拉伸势能有显著影响。移动coiledcoil所受到的拉伸应力和拉伸势能随着温度的升高而降低。NaCl浓度为0.5M及H+/OH-浓度为5.0时(T=300K)，移动coiledcoil所受到的拉伸应力(＜600KJ?mol-1?nm-1)和拉伸势能(0.78?105KJ/mol)达到最小，其它的NaCl浓度和H+/OH-浓度将使得移动coiledcoil所受到的拉伸应力和拉伸势能变大。更高的温度(280K~340K)，适宜的NaCl浓度(0.5M)和H+/OH-浓度(5.0)将有利于肌球蛋白从粗丝结构中解离出来。
3环境条件对coiledcoil及其多聚体结构参数及溶剂化能力的影响
采用分子模拟的方法研究了温度、NaCl浓度及H+/OH-浓度等环境条件对模拟体系中coiledcoil和coiledcoil七聚体的结构参数及溶剂化能力的影响。随着温度升高coiledcoil结构的收缩程度变大，而七聚体则发生了明显的膨胀，较高温度(＞320K)导致七聚体构象变化，处于不稳定状态，320K是coiledcoil及其七聚体构象改变的起始温度。温度为300K(26.8℃)时，coiledcoil及其七聚体的溶剂化自由能最大，在水中处于最稳定状态。升高温度将削弱氢键和离子键作用，导致coiledcoil及其七聚体与水分子的溶剂化作用呈下降趋势；随着NaCl浓度增加，水溶液中coiledcoil分子结构的收缩程度变大。而七聚体的结构在低盐条件(＜0.2M)下有小幅度的收缩，较高盐浓度下(0.4M~0.8M)七聚体结构存在明显的膨胀。极高NaCl浓度(＞0.8M)下，coiledcoil及其七聚体结构发生了盐致构象变化，coiledcoil结构产生剧烈的收缩，而七聚体结构在模拟过程中coiledcoil的有序堆砌模式遭到了破坏。低盐环境下coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化能力较弱，NaCl浓度为0.2M时，coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化自由能最小，coiledcoil及其多聚体在水溶液中的稳定性差容易相互聚集。而在较高盐浓度下，提高NaCl浓度能够明显的增加coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化自由能，在不导致盐致构象变化的情况下，0.6M左右的NaCl浓度是coiledcoil单体存在于溶液中或是coiledcoil多聚体解离的最佳离子环境；H+/OH-浓度7.0时coiledcoil及其七聚体结构较为稳定，H+/OH-浓度远离中性时coiledcoil及其七聚体均出现明显的先收缩而后膨胀的现象，极酸或极碱可能破坏了蛋白分子内的离子键和氢键，使得蛋白结构不可逆的构象变化。H+/OH-浓度5.0时coiledcoil及其七聚体分子的溶剂化自由能最小，H+/OH-浓度5.0为草鱼肌球蛋白coiledcoil的等电点，coiledcoil及其七聚体结构最终的收缩幅度最大。随着溶液酸碱环境偏离pI5.0，分子的溶剂化自由能呈逐渐增加的趋势，coiledcoil及其七聚体在偏酸性或碱性的溶液中也更加稳定。
4NaCl离子在肌原纤维蛋白中的扩散特性
采用分子动力学模拟的方法研究NaCl离子在肌原纤维模拟结构中的扩散特性。NaCl离子与coiledcoil带电残基的静电相互作用是其扩散迁移的主要阻力。模拟实验中NaCl离子使得肌原纤维模拟结构发生了膨胀，coiledcoil分子间隙变大，盐离子与带电残基的静电作用力降低。Fick第二定律的双边平板模型能够很好的用来描述NaCl在肌原纤维模拟结构中的扩散分布。垂直于肌原纤维和平行于肌原纤维两个方向上，NaCl的扩散存在异向性。垂直于肌原纤维和平行于肌原纤维方向的NaCl扩散系数Dx和Dy均随着模拟时间的延长呈现下降趋势，随着温度升高，Dx和Dy的值增大。NaCl的扩散系数Dy(16.7×10-9~120×10-9m2/s)值大于Dx(2.91×10-9~88.8×10-9m2/s)。改进型Arrhenius方程能够极好的拟合NaCl扩散系数Dx或Dy与温度及模拟时间的关系，NaCl的垂直方向扩散活化能(6.144 KJ/mol)要大于平行方向扩散活化能(5.510 KJ/mol)，表明NaCl在垂直于肌原纤维方向扩散比在平行于肌原纤维方向扩散需要消耗更多的能量。草鱼片腌渍实验计算出的NaCl扩散系数和扩散活化能与本文模拟实验的结果基本一致，研究表明，采用分子动力学与实验相结合的方法确定NaCl在肌原纤维蛋白中的扩散系数和扩散活化能具有较高的准确性。