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新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是围产期各种因素引起脑组织部分或完全性缺氧,脑血流减少或暂停而导致的缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD),是新生儿死亡和继发智力障碍、脑瘫等伤残的主要原因之一。迄今为止,临床尚缺乏HIE特异性诊断标志物和有效治疗手段。因此,深入其机制研究,对于优化早期干预治疗方案和降低患儿死亡率及伤残率,具有重要临床价值和意义。免疫炎症反应在HIE的病理机制中扮演重要角色,但其具体机制仍不明确。TLR4是一种天然免疫模式识别受体,在免疫炎症反应的诱导和调节中起重要作用。自噬是细胞代谢保持稳态的重要调控机制。研究发现TLR4可以作为自噬的环境感受器,诱导细胞自噬激活。然而HIE后脑损伤过程是否存在TLR4/NF-KB信号通路介导的神经元细胞自噬过度激活和炎症细胞因子释放尚不明确。本研究通过动物模型和临床研究,探索TLR4/NF-KB信号通路介导的神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑病免疫炎症损伤中的作用及其分子机制。第一部分 TLR4/NF-KB信号通路及神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马免疫炎症损伤中的作用目的:观察HIBD新生大鼠海马免疫炎症损伤过程中TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬相关蛋白表达水平的时间变化规律,分析两者水平变化趋势在时间上是否具有一致性。方法:将7日龄健康清洁级新生Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组、HIBD组;采用Rice-vannucci方法结扎左侧颈总动脉后再缺氧2.5h建立新生大鼠HIBD模型,分别于缺氧缺血后观察以下指标:1.负趋地性实验(Negative geotaxis test)、翻正反射实验(Righting reflex test)和平衡木实验Feeney评分测试神经行为功能以评估新生大鼠近、远期神经行为功能损害程度:2.TTC染色测定新生大鼠脑梗死体积;3.肉眼观察脑组织大体形态学损伤;4.HE染色观察左侧海马组织病理形态学损害;5.免疫组化检测左侧海马CA1区TLR4信号通路以及自噬相关蛋白TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3阳性细胞表达;6.Western blot测定左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3蛋白表达水平时间变化趋势;7.ELISA检测左侧海马组织TLR4/NF-KB信号通路下游炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平时间变化趋势;8.分析TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬相关蛋白表达水平变化趋势在时间上的一致性。结果:1.近、远期神经行为功能测试:假手术组大鼠左右肢体活动正常,能迅速翻转身体,抓牢平衡木有力,通过平衡木迅速,无摔落现象,左右肢体运动协调能力完好。HIBD组大鼠右侧肢体明显无力,翻转身体时间明显延长,通过平衡木缓慢,不能抓牢平衡木,甚至有摔倒或跌落平衡木,测试成绩明显低于假手术组大鼠(P<0.05),左右肢体运动协调、整合能力差。2.TTC染色:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球TTC染色后脑组织呈现均匀的红色,无明显梗死灶;HIBD组新生大鼠左侧脑组织发生大面积苍白色梗死灶(P<0.05)。3.脑组织大体形态学观察:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球对称,形态规整,脑组织透明清澈,无水肿、浑浊及液化坏死现象。HIBD组新生大鼠两侧大脑半球不对称,左侧大脑半球明显饱满,并可见不同程度的脑组织水肿、浑浊及液化坏死现象。4.海马组织病理形态学变化:假手术组新生大鼠左侧海马组织结构清晰,神经元细胞排列整齐紧密,细胞形态正常。HIBD组新生大鼠在缺氧缺血后24h出现左侧大脑海马组织结构紊乱,神经元细胞排列疏松不齐,细胞水肿,少量细胞核固缩、碎裂及神经细胞坏死现象;48h后损害进一步加重,并出现明显细胞核固缩、碎裂,细胞间隙扩大,血管扩张以及神经细胞大量坏死现象。5.免疫组化检测TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3阳性细胞表达:TLR4以胞浆、胞膜着色为主,p-NF-κB以胞核着色为主,Beclin-1、LC3均以胞质着色为主。假手术组新生大鼠左侧海马组织CA1区仅少量TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3阳性细胞表达;HIBD组新生大鼠左侧海马组织 TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达明显升高(P<0.05)。6.Western blot、ELISA测定TLR4/NF-KB信号通路和自噬相关蛋白水平时间表达趋势:假手术组新生大鼠左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、Beclin-1、LC3表达均处于低水平;HIBD组新生大鼠左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、Beclin-1、LC3表达水平在HIBD后逐渐增高,48h达高峰,72h逐渐下降(P<0.05),水平变化趋势在时间上基本保持一致。结论:1.HIBD新生大鼠海马免疫炎症损伤过程存在TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬的激活2.HIBD新生大鼠海马免疫炎症损伤过程中TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬相关蛋白表达水平变化趋势在时间上具有一致性,TLR4/NF-κB信号通路可能是神经元细胞自噬激活的关键启动因素。第二部分TAK-242通过TLR4/NF-κB信号通路调节HIBD新生大鼠海马神经元细胞自噬的作用研究目的:观察TLR4特异性拮抗剂TAK-242对HIBD新生大鼠海马神经元细胞自噬的影响,阐明TAK-242通过抑制TLR4/NF-KB信号通路介导的神经元细胞自噬调控HIBD后海马免疫炎症损伤的分子机制。方法:将7日龄健康清洁级新生SD大鼠随机分为假手术组、HIBD+溶媒组、HIBD+TAK-242(0.75mg/kg)组、HIBD+TAK-242(1.5mg/kg)组、HIBD+TAK-242(3mg/kg)组;采用 Rice-vannucci方法建立新生大鼠HIBD模型,分别于缺氧缺血后观察以下指标:1.神经功能缺损评分、转棒实验(Rotarod task)和平衡木实验(Beam walking test)测试神经行为功能以评估大鼠神经功能损害程度;2.TTC染色测定新生大鼠脑梗死体积;3.脑干湿比重法测定脑组织含水量以评估脑水肿程度;4.肉眼观察脑组织大体形态学损害;5.HE染色观察左侧海马组织病理形态学变化;6.免疫组化检测新生大鼠左侧海马组织CA1区TLR4信号通路及自噬相关蛋白TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达;7.Western blot测定新生大鼠左侧海马组织TLR4信号通路及自噬相关蛋白TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 表达水平;8.ELISA测定左侧海马组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平。结果:1.神经行为功能测试:假手术组大鼠左右肢体活动正常,运动整合、协调能力完好,奔跑迅速,无跌倒现象。HIBD+溶媒组大鼠右侧肢体明显无力,神经行为功能测试成绩明显低于假手术组,运动整合、协调能力差(P<0.05)。而与HIBD+溶媒组大鼠相比,HIBD+TAK-242组大鼠神经功能缺损明显改善,转轮时间明显增加,平衡木穿行时间明显减少,表现出更好的运动整合、协调能力,其中以高剂量组(3mg/kg)效果最明显(P<0.05)。2.TTC染色:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球TTC染色后脑组织呈现均匀的红色,无明显梗死灶;HIBD+溶媒组新生大鼠左侧脑组织发生大面积苍白色梗死灶(P<0.05):与HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242组新生大鼠左侧脑组织脑梗死体积明显减少,其中以高剂量组(3mg/kg)减少最明显(P<0.05)。3.脑水肿程度测定:假手术组新生大鼠脑组织含水量恒定;HIBD+溶媒组新生大鼠脑组织含水量明显增加(P<0.05);与HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242组新生大鼠脑水肿含量明显降低(P<0.05)。4.脑组织大体形态学改变:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球对称,脑组织透明清澈,无水肿、浑浊及液化坏死现象。HIBD+溶媒组新生大鼠两侧大脑半球不对称,左侧大脑半球明显饱满,并可见不同程度的脑组织水肿、浑浊及液化坏死现象;HIBD+TAK-242组新生大鼠左右两侧大脑半球基本对称,左侧脑组织呈轻度水肿、浑浊状态,且程度明显减轻、范围明显减少,无明显脑组织液化坏死现象出现。5.海马组织病理形态学变化:假手术组新生大鼠左侧海马组织结构清晰,神经元细胞排列整齐紧密,细胞形态正常。HIBD+溶媒组呈现海马组织结构紊乱,神经元细胞排列疏松不齐,细胞水肿,细胞核固缩、核碎裂以及神经细胞坏死现象。HIBD+TAK-242组海马组织损害较轻,神经元细胞排列较整齐、致密,仅少数神经细胞出现水肿、坏死现象,且程度明显轻于HIBD+溶媒组。6.免疫组化检测TLR4信号通路及自噬相关蛋白阳性细胞表达:Beclin-1、LC3以胞质着色为主,MyD88、TRIF以胞浆着色为主。假手术组新生大鼠左侧海马组织仅少量TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达;HIBD 后左侧海马组织 TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3阳性细胞表达明显升高(P<0.05),而应用TAK-242干预后左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达明显减少(P<0.05)。7.Western blot测定TLR4信号通路及自噬相关蛋白水平:假手术组新生大鼠左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3呈现低水平表达;HIBD+溶媒组新生大鼠左侧海马组织 TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 表达水平明显增高(P<0.05);与 HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242 组新生大鼠 TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 表达水平明显下降(P<0.05)。8.ELISA检测炎症细胞因子水平:假手术组新生大鼠左侧海马组织TNF-α、IL-1β处于低水平;HIBD+溶媒组新生大鼠左侧海马组织TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.05);与HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242组新生大鼠TNF-α、IL-1β水平明显降低(P<0.05)结论:1.新生大鼠HIBD后海马免疫炎症损伤过程存在TLR4信号通路介导的神经元细胞自噬过度激活;2.TAK-242可能通过阻断TLR4/NF-KB信号通路,抑制神经元细胞自噬和减少下游炎症细胞因子释放,减轻HIBD后海马免疫炎症损伤,发挥神经保护作用。第三部分 缺氧缺血性脑病新生儿外周血TLR4信号通路、自噬相关蛋白表达水平及意义目的:观察TLR4信号通路、自噬相关蛋白在缺氧缺血性脑病新生儿外周血中的表达,分析其与新生儿行为神经测定(NBNA评分)的相关性,探讨其与新生儿HIE严重程度和近期预后的关系,从而评价其临床病情判断和预后评估价值。方法:1.收集2018年7月-2019年7月扬州大学附属医院NICU收治的HIE新生儿21例,按HIE严重程度将患儿分别分为轻度HIE组、中度HIE组和重度HIE组,健康新生儿为对照组;2.采用Western blot检测外周血单核细胞TLR4、Beclin-1、LC3蛋白表达;3.利用ELISA测定外周血血清TNF-α和IL-1β水平;4.并行新生儿行为神经测定(NBNA评分);5.分析TLR4、Beclin-1、LC3蛋白表达水平与NBNA评分相关性,评估TLR4、Beclin-1、LC3水平与HIE严重程度和近期预后的关系。结果:1.HIE各组患儿外周血TLR4、Beclin-1、LC3、TNF-α、IL-1β水平均明显高于对照组健康新生儿(P<0.05),且随HIE严重程度而增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2.HIE各组患儿NBNA评分明显低于对照组健康新生儿,且随HIE严重程度而降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.HIE患儿外周血单核细胞TLR4、Beclin-1、LC3蛋白表达水平与NBNA评分均呈明显负相关(P<0.05)。结论:1.TLR4、Beclin-1、LC3水平检测是新生儿HIE病情严重程度判断以及近期预后评估较敏感指标;2.TLR4信号通路及自噬参与新生儿HIE免疫炎症性脑损伤过程,其可能是HIE重要致病机制之一。