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背景:年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)是全球范围内首位的能够引起不可逆性盲的眼底病,多见于60岁以上人群,并且其发病率随年龄增长而逐渐增加。AMD的确切病因暂不明确,研究者认为可能与黄斑长期光损伤、遗传因素、代谢因素有关。根据AMD的临床表现不同,一般将其分为干性AMD,又称萎缩性或非新生血管性AMD;以及湿性AMD,又称渗出性或新生血管性AMD。其中,脉络膜新生血管膜(Choroid Neovascularization,CNV)是湿性AMD的发病特征,一般由玻璃膜的变性损害诱发,逐步侵入视网膜色素上皮下,引起渗出和出血性脱离。临床上主要依靠基于抗血管内皮生成因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)原理研发的药物来治疗湿性AMD的CNV。但是一方面存在经济费用较高,另一方面临床上也存在对抗VEGF药物应答不明显的患者。所以针对AMD的发病机制,我们仍需要进一步研究,以寻求其他的治疗办法。目前,明确的是AMD与慢性轻度的全身或局部炎症反应密切相关,炎症在新生血管性AMD的发病中起到不可忽视的重要作用。临床上也有常见一些抗炎性药物玻璃体腔注射的治疗方法,包括近年来出现的玻璃体腔缓释型抗炎药物的注射,在某些疾病类型中得获得了很好的治疗效果。由于免疫相关的反应包括补体激活、单核细胞募集和巨噬细胞活化等一系列复杂的病理性过程。AMD病程中的炎性致病作用机制值得更加深入的研究。据报道,在新生血管性AMD患者外周血中存在表达炎症相关基因的单核细胞,并且在人AMD患眼中检测到大量巨噬细胞。巨噬细胞参与调控CNV的形成过程,与AMD的发生发展密切相关。酪氨酸蛋白激酶受体2(Tyrosine-protein kinase receptor,Tie2)是血管生成素的细胞表面受体,调节血管生成、内皮细胞存活、增殖、迁移、粘附和细胞扩散,重组肌动蛋白细胞骨架,并维持血管静止。根据微环境不同,起到激活或抑制血管生成的作用。一般表达于内皮细胞,也存在于巨噬细胞表面。Tie2+巨噬细胞(Tie2 expressing macrophages,TEMs)近年来愈发受到研究者的关注,它是巨噬细胞亚群中的一类,存在于人外周血细胞。研究发现,TEMs在肿瘤微环境以及组织创伤重塑过程中表现出强大的促进血管生成作用。敲除TEMs后,肿瘤复发和肢端创伤修复过程中的血管新生均受到抑制。甚至,有报道称促进TEMs募集有利于新生血管形成。至今,TEMs在AMD发病中所扮演的角色尚不清楚。鉴于此,本文将从TEMs参与炎性反应和对肿瘤新生血管形成等研究提示出发,分析TEMs在激光诱导脉络膜新生血管形成过程中的调控和具体作用机制,深入阐明新生血管性AMD的发病机制,为临床疾病诊治提供更加切实可靠的理论依据。第一部分 TEMs在激光诱导脉络膜新生血管形成过程中的作用和机制目的探索TEMs在激光诱导脉络膜新生血管发生过程中的作用和具体机制。方法选用C57BL/6小鼠作为背景动物,采用激光诱导脉络膜损伤方法构建脉络膜新生血管动物模型。于激光损伤后0d、1d、3d、5d、7d、14d,通过流式细胞检测技术观察脉络膜中TEMs表达的动态变化过程;选择Cre-loxP体系构建条件性巨噬细胞 Tie2 信号敲除小鼠,将 LyzCre+;Tie2flox/flox 设为 TEM-KO 组,LyzCre+;Tie2flox/+组设为对照组,同时设立Tie2抑制剂(Tie2 kinase inhibitor,TKI)玻璃体腔注射组作为阳性对照。使用眼底荧光血管造影(fluorescein fundus angiogram,FFA)和荧光葡聚糖灌注后视网膜/脉络膜/巩膜组织铺片的方法,评估激光损伤后7d各组CNV的形成情况;收集激光损伤后0d、1d、3d、5d、7d、14d的视网膜/脉络膜/巩膜样本,流式细胞法检测对照组和TEM-KO组的视网膜/脉络膜/巩膜组织中巨噬细胞的募集;使用RT-PCR和Western Blot的方法检测组织内血管生成相关因子VEGF-A、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、磷酸化 v-Akt 鼠胸腺瘤病毒致癌基因(phosphorylation v-Akt murine thymoma viral oncogene,p-AKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、cleaved-caspase3 的表达水平;取激光损伤后 0d、5d、7d、14d 脉络膜组织,annexin V/PI双染色法测以CD31标记的血管内皮细胞的凋亡率。结果激光诱导脉络膜新生血管小鼠模型构建后,脉络膜TEMs表达水平出现显著的动态变化。与0d相比,1d、3d、5d、7d的Tie2+F4/80+细胞百分比逐渐升高,于7d达到峰值,14d出现降低。敲除巨噬细胞表达的Tie2信号后,TEM-KO与对照组间的F4/80+细胞在激光损伤后0d、1d、3d、5d、7d和14d均无明显差异。FFA和共聚焦显微镜拍照发现,TEM-KO组的CNV面积和渗漏评分与对照组相比均明显下降,且与TKI组相比无明显差异。TEM-KO组中bFGF的mRNA动态变化水平与对照组一致,在损伤后3d达峰值,且TEM-KO组中的峰值明显低于对照组。但TEM-KO组中IL-10的mRNA表达峰值出现在激光损伤后1d,且明显高于对照组中出现在3d的峰值。在Western Blot实验中,激光损伤后两组中的p-AKT、p-ERK、VEGF-A、cleaved-caspase3蛋白表达水平均逐渐增高,至3d达到峰值而后下降,14d降至正常水平;不同的是,TEM-KO组中各蛋白表达水平的峰值均低于对照组。敲除巨噬细胞Tie2表达后,脉络膜组织中CD31+细胞凋亡率在激光损伤后7d达到峰值,随后在14d降到正常水平,且峰值较对照组明显增加。结论TEMs促进激光诱导脉络膜新生血管的形成;其机制可能与巨噬细胞表面Tie2信号促进血管新生相关因子分泌、促进细胞增殖因子的分泌,并抑制细胞凋亡等作用相关。第二部分 Tie2+巨噬细胞对血管内皮细胞的直接作用和机制目的检测TEMs对血管内皮细胞的功能的影响,并探讨巨噬细胞表面Tie2信号引起血管新生的作用机制。方法选择Cre-loxP体系构建巨噬细胞Tie2信号敲除小鼠,刺激并收集TEM-KO小鼠和对照小鼠腹腔来源巨噬细胞。使用流式细胞技术检测两组巨噬细胞中CD86+和CD206+细胞在总细胞数中所占百分比,观察巨噬细胞Tie2信号敲除是否影响巨噬细胞极化。体外培养小鼠腹腔来源巨噬细胞,收集巨噬细胞上清液,将其作用于小鼠脑微动脉血管内皮细胞(b.End3),将TEM-KO组巨噬细胞上清液刺激的b.End3设为MTie2-组,对照组巨噬细胞上清液刺激的b.End3设为MTie2+组,分别正常条件在和缺氧条件下观察两组b.End3细胞中VEGF-A、bFGF、IL-1α和IL-10的mRNA表达水平;划痕法检测不同巨噬细胞上清液对b.End3细胞增殖和迁移的影响;Transwell法检测不同巨噬细胞上清液对b.End3细胞迁移的影响;基质胶(Matrigel)三维内皮细胞管腔成型法检测不同巨噬细胞上清液对b.End3细胞管腔形成的影响;Western Blot检测不同培养基作用24后,DMEM组、MTie2-组、MTie2+组中b.End3血管内皮细胞p-AKT、p-ERK、VEGF-A的蛋白表达水平;TEM-KO巨噬细胞和对照组巨噬细胞上清液分别作用b.End3 6h、12h、24h后,Annexin V/PI双染色法流式细胞仪检测比较MTie2-组和MTie2+组细胞凋亡率,以及通过Western Blot检测cleaved-caspase3的蛋白表达水平。结果与对照组相比,敲除巨噬细胞表面Tie2信号后,CD86+F4/80+和CD206+F4/80+细胞比例未发生明显变化。缺氧条件下,MTie2-组和MTie2+组中b.End3细胞的VEGF-A、bFGF、IL-1α和IL-10 mRNA表达水平均高于正常条件;在正常条件下,与MTie2+组相比MTie2-组中VEGF-A和IL-1α表达明显降低;但MTie2-组的IL-10表达水平无论在正常条件还是在缺氧条件下,均明显升高。观察不同培养基分别作用b.End3细胞12h、24h。在两个不同实验时间点中,与DMEM组相比,MTie2-组和MTie2+组细胞迁移面积均明显增加,MTie2+组细胞迁移面积比MTie2-组增加更为明显;Transwell结果显示,与DMEM组相比,MTie2-组和MTie2+组细胞迁移数量均明显增加,MTie2+组细胞迁移数量比MTie2-组增加更为明显;与DMEM组相比,MTie2-组和MTie2+组管腔形成节点数明显增多,且MTie2+组更为明显。通过Western Blot检测发现巨噬细胞上清液促进b.End3细胞中促血管新生和细胞增殖的VEGF-A和p-AKT的表达。经流式细胞仪细胞凋亡检测和Western Blot法cleaved-caspase3蛋白表达检测发现,与对照组相比,巨噬细胞Tie2敲除促进血管内皮细胞凋亡。结论巨噬细胞Tie2信号可能通过调控促血管生成因子释放,促细胞增殖,促炎和抑制细胞凋亡的多重信号途径增强b.End3细胞生物学效应,有利于血管新生。