独山瓜馥木茎抗结核杆菌成分及作用机制初探

• 作 者: 安婷婷
• 出 处: 贵州大学
• 发表日期: 2020年01期
• 关键词: 结核病 结核杆菌 独山瓜馥木 作用机制

结核病（Tuberculosis,TB）是由于结核杆菌（Mycobacterium Tuberculosis,MTB）而引起的慢性致死性传染病,可侵犯全身脏器,严重威胁人类的身体健康。近年来,伴随人口流动的加速,用药不合理以及抗结核药物作用靶点的突变,导致耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的不断出现,再加上近年来患有艾滋病（AIDS）人口数量的增长,结核病与人类免疫缺陷病毒（HIV）并发发病率急剧上升,给结核的治疗带来了严峻的挑战。因此,研发新型抗结核药物成为控制和治疗结核病的迫切要求。我国中药来源丰富,品种繁多,天然无污染可再生,毒副作用低且不易产生耐药性,这使中药在日益严重的形势下具有一定的优势。本课题利用贵州中草药资源的多样性,以及民族医药文化的独特性,通过前期活性筛选,发现贵州地道药材独山瓜馥木具有抗结核杆菌活性。对独山瓜馥木乙醇提取物（600 g）进行分段萃取,得到石油醚部位（80 g）、乙酸乙酯部位（80 g）、二氯甲烷部位（120 g）以及剩余物（250 g）四个部分。通过活性追踪,结果显示石油醚部位、乙酸乙酯部位以及剩余物的最小抑菌浓度（MIC）值均大于160μg/m L,视为无效,而二氯甲烷部位MIC值为160μg/m L,确定二氯甲烷萃取物为活性部位。将二氯甲烷部位采用硅胶柱色谱继续分离,得到Fr.A～Fr.G共7个组分。其中仅有Fr.C和Fr.D对结核杆菌的MIC范围在100～200μg/m L,但Fr.C比Fr.D活性稍高。随后,通过薄层色谱（TLC）和硅胶柱层析对Fr.C组分进行多次纯化,分离得到具有抑制结核杆菌活性化合物GF-01（16 mg）,对结核杆菌的MIC为80μg/m L。化合物GF-01为白色粉末状,溶于二氯甲烷和甲醇;能使改良碘化铋钾生物碱显色剂呈红色,说明活性单体为生物碱类化合物;能使酸化的氯化铁溶液呈红色,表明活性单体含S元素。综合波谱分析数据并结合参考文献对照,鉴定化合物为3-（6-羟基-9-氧代-9H-芴-1-基）丙硫酰肼。Fr.D组分具有抗结核活性,但由于其极性较大,仅依靠常规的硅胶柱分离技术难以达到理想结果。为了明确其主要化合物种类,故该组分选用分离效能高、灵敏度高的LC-MS手段进行分离,对含量较高的2个化合物进行MS分析,表明Fr.D组分主要由化合物GF-02（2-硫氧-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺）和化合物GF-03（邻苯二甲酐）组成。为初步揭示化合物GF-01的作用靶点,首先运用分子对接技术将该分子与结核杆菌相关靶点进行虚拟对接,结果显示UDP-吡喃半乳糖变位酶为潜在靶点。然后采用荧光定量PCR技术,测定结核杆菌UDP-吡喃半乳糖变位酶基因（glf）转录水平,对靶点进行初步验证。结果显示,与空白对照比较,被单体化合物GF-01干预后的结核杆菌的基因glf表达量出现下调,其2^-??值是空白对照的0.36倍,提示活性化合物对UDP-吡喃半乳糖变位酶无抑制作用,而可能是galE1或glfT的抑制剂。