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目的： 在导师团队以往发现行气活血法常用中药预知子具有诱导肝癌细胞严重内质网应激的基础上，进一步: 1.分离预知子种子中诱导内质网应激的主要成分; 2.探索该主要成分诱导肝癌细胞内质网应激的作用机制。 方法： 1.预知子种子醇提物诱导肝癌细胞内质网应激有效成分筛选实验 ①预知子种子分离提取:采用乙醇回流提取预知子种子，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，大孔树脂，硅胶，反相硅胶柱层析逐步分离。 ②在以上实验中，联合体外实验，筛选各阶段萃取或分离物中具有诱导内质网应激成分，并作为进一步分离的基础，最终获得单一成分。 ③高效液相、超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱、核磁共振检测:确定有效成分的分子量、分子式、分子结构。 2.木通皂苷E诱导肝癌细胞内质网应激的作用机制研究 ①通过表达谱芯片技术观察木通皂苷E给药后出现显著差异表达基因。 ②通过内质网应激通路显著差异性表达基因RNAi，观察其表达沉默后，木通皂苷E对SMMC7721肝癌细胞形态学及增殖(MTT)的影响。 ③通过RTqPCR及Western blot观察目的基因被沉默的程度，借此分析木通皂苷E诱导肝癌细胞内质网应激的作用机制。 结果： 1.预知子种子醇提物诱导肝癌细胞内质网应激有效成分筛选实验 ①对预知子种子醇提物进行石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分离，发现诱导内质网应激的成分富集在正丁醇萃取物中。 ②该正丁醇萃取物经大孔树脂柱层析分离，发现诱导内质网应激的成分富集在50％乙醇洗脱物中。 ③该50％乙醇洗脱物进行硅胶柱层析分离，发现诱导内质网应激的成分富集在第4部分洗脱物(Fr.4)中。 ④该第4部分反相硅胶柱层析分离，发现诱导内质网应激的成分富集在J10部分洗脱物中。 ⑤高效液相色谱检测，超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱检测，核磁共振检测结果显示:J10即为木通皂苷E。 ⑥木通皂苷E分子量C52H84O22，分子式1060，分子结构如下: 2.木通皂苷E诱导肝癌细胞内质网应激的作用机制研究 ①基因芯片检查结果显示，木通皂苷E对肝癌细胞FDFT1、HMGCS1、MSMO1、SQLE、SC5D等胆固醇合成通路相关特异性基因具有明显的上调作用。 ②RTqPCR结果显示，INSIG1、SREBF1、SREBF2、SCAP、SQLE等5个基因经RNA干扰后，核酸数量下调50～75％。敲除成功。 ③MTT结果显示，INSIG1、SREBF1、SREBF2、SCAP、SQLE敲除后，肝癌细胞增殖趋向不活跃，但细胞形态学未见明显改变;再予以木通皂苷E给药，细胞仍会出现空泡，但是空泡发生的数量、严重程度反而较非敲除细胞为少。 结论： 1.预知子种子诱导肝癌细胞内质网应激的主要成分是木通皂苷E。 2.木通皂苷E的特点是诱导肝癌细胞严重的内质网应激，提示其用药前景在于与其他不同作用靶点的抗肿瘤药物联合使用，实现减量增效。 3.木通皂苷E还可作为诱导细胞内质网应激的实验用试剂。 4.给予木通皂苷E干预后，可以诱导固醇调节级联反应通路INSIG1等基因以及胆固醇合成通路基因表达增加，提示木通皂苷E在引发内质网膜结构和功能紊乱后，诱导这些通路基因的表达增加。 5.木通皂苷E诱导肝癌细胞内质网应激的空泡形成可能与INSIG1、SREBF1、SREBF2、SCAP等基因参与有关。 6.INSIG1、SREBF1、SREBF2、SCAP等基因表达对于肝癌细胞恶性增殖具有一定的促进作用。