论文部分内容阅读
近年来，随着生物技术在农业中的广泛应用，辣椒（Capsicum annuumL.）作为世界性的大众蔬菜也越来越多地利用生物技术来育种，特别是转基因育种也受到越来越多人的关注。通过基因工程的方法把抗虫基因导入辣椒当中，并选育出具有抗虫性状的辣椒新品种。
随着人们对转基因技术的进一步的认识，人们越来越关注转基因作物的安全性。主要的担心就是在转基因的过程中目的基因和标记基因一同整合到植物的DNA组中，而留下的抗生素抗性基因和除草剂抗性基因可能会对环境和人体健康造成潜在的危害，最有效的解决之道就是采用正向筛选安全标记基因。
本实验就是利用正向安全标记基因(pmi)对转化植株进行了筛选，并对转化植株进行了检测，最后对转化植株进行了抗虫实验。主要取得了以下研究结果：
1.构建了pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI植物表达载体
从含有Cry2Aa2基因的T载体克隆Cry2Aa2基因，连接到pMD-19克隆载体中，并进行双酶切，连接到含有相同酶切位点的pCAMBIA1301-PMI植物表达载体中，最后获得了pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI植物表达载体。
2.辣椒转化体系的建立
本实验采用农杆菌介导的方法把目的基因转到辣椒中去，所用的筛选体系是甘露糖筛选体系。由于纯的甘露糖对植物有比较大的毒害作用，而掺有一定蔗糖的甘露糖可以缓解甘露糖对植物的危害作用，因此采用甘露糖和蔗糖按一定的比例配成的筛选培养基来筛选，并探索合适的筛选比例。对种子萌发率和不定芽分化率做了6个梯度，当蔗糖浓度/甘露糖浓度(g／L)为20／30时，种子的发芽率为0，而不定芽已经不分化且变褐枯死，因此可以初步采用蔗糖浓度/甘露糖浓度(g／L)为20／30的培养基去筛选转化苗。
用Cef(200mg／L)就可以抑制住农杆菌的生长，而更高浓度的Cef会显著抑制不定芽的分化，所以本实验采用的Cef浓度为200mg／L。外植体预培养1～2d会更有利于农杆菌的侵染，并把预培养的外植体放入扩摇好的大概OD600=0.4～0.6的农杆菌农杆菌液中侵染10min，无菌滤纸吸去残留菌液后，重新接入分化培养基中暗培养2d，转至抑菌培养基和含有蔗糖浓度/甘露糖浓度(g／L)为20／30的筛选培养基上，非转化的苗就会逐渐地黄化和枯死，最终获得了能在甘露糖生长的转化植株。
3.转基因植株的鉴定
对转化植株的DNA进行提取，并进行目的条带的PCR扩增，共有15株植株扩增出目的条带，其中品种Ⅰ有7株呈阳性，品种Ⅱ有8株呈阳性，PCR阳性率为53.57％，转化率大约为0.6%。其中对部分PCR呈阳性的植株进行了Southern杂交，结果表明有5株表现为阳性。通过抗虫检测表明取食转基因植株叶片或果蕾幼虫的校正死亡率要大于阴性对照，并且体重增加缓慢，呈现出厌食和僵化的状态，对叶片或果蕾的伤害较轻，表明了具有一定的抗虫性，从而初步表明目的基因（Cry2Aa2基因）已经整合到了辣椒基因组中。