菠萝AcSERK启动子的克隆及AcSERK正义表达载体对菠萝的遗传转化

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lihaiyun718
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SERK(体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因)是一个基因家族,每种植物有1~6个不等的成员,每个成员结构和功能存在差异。本论文对菠萝(Ananas comosus cv。Shenwan)中存在的2个AcSERK的启动子进行了克隆分析,并探讨了AcSERK1过量表达情况下对菠萝体细胞胚发生的影响,为进一步研究它们的表达调控规律和功能鉴定提供依据。主要研究结果如下:  采用hi-TAIL PCR方法,分别从菠萝基因组DNA中分离得到了AcSERK2起始密码子ATG上游的223 bp的5’启动子片段和AcSERK3起始密码子ATG上游的464 bp的启动子片段(Genebank accession number:JQ734992)。利用Plant CARE软件对顺式作用元件预测分析表明,AcSERK2的启动子片段具有光响应、激素响应元件外,还具有细胞周期调节响应元件MSA-like、生理周期调节元件circadian及MYBHv1结合位点(CCAAT-box)等;AcSERK3的启动子片段不仅具有TATA-box和CAAT-box等核心元件,也具有光响应和多个激素响应,还具有厌氧诱导响应元件。这说明这2个启动子中转录元件具有一定保守性,但也存在差异。  用限制性内切酶BamHI和NcoI同时对AcSERK3的5’侧翼片段和表达载体p35s-GFP-1进行双酶切,经回收后,连接、转化和鉴定,成功构建了启动子瞬时表达载体pSERK3-GFP-1。  将菠萝愈伤组织经分别含有植物表达重组质粒(pFGC5941-AcSERK1-bar、pFGC5941-AcSERK2-bar、pFGC5941-AcSERK3-bar)的根癌农杆菌(LBA4404菌株)侵染,共培养2~3 d后,转入选择培养基(MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+400 mg/LCarb+1 mg/L PPT)上培养10 d后开始分化出不定芽;将绿色的抗PPT不定芽在不含有PPT的上述培养基中恢复培养15~20 d,继续转入选择培养基(MS+2.0 mg/L BA+1.0mg/L NAA+300 mg/L Carb+2 mg/L PPT)和(MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+200 mg/LCarb+3 mg/L PPT)上再进行连续2代筛选,随后将绿芽转入MS+1.0 mg/L NAA上生根。经过连续3代选择培养,分别获得了128株转AcSERK1、93株转AcSERK2、58株转AcSERK3的PPT抗性植株。经PCR检测,分别有2株AcSERK1和1株AcSERK2呈阳性;经Southern杂交检测,PCR阳性植株均出现明显的杂交信号,表明AcSERK1、AcSERK2已经插入到菠萝基因DNA中。  转AcSERK1的愈伤组织在体细胞胚诱导培养基上暗培养40 d后,平均每克愈伤组织能获得9.22个胚性愈伤组织颗粒,比对照高74.0%;继续在分化培养基中光照培养30 d后,平均每克愈伤组织能获得17.12个体细胞胚,比对照高97.5%。结果表明:AcSERK1的过量表达对菠萝胚性细胞的形成和体细胞胚的发生具有显著的促进作用。
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