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番茄(Solanum lycopersicum)果实丰富的分子遗传背影和重要的经济价值,使番茄成为研究肉质果实发育和成熟的模式植物。然而,番茄极易受到病毒的侵染,导致其产量和品质降低。因此了解病毒侵染对番茄花和果实发育过程的调控机制的影响越来越重要。
microRNAs(miRNAs)是一种广泛的存在于真核生物中,长约21 nt,具有基因表达负调控功能的非编码小分子RNA,它可通过碱基互补配对原则引导沉默复合体切割靶基因或者阻止靶基因翻译,从而调控基因的表达。miRNAs参与植物生长发育过程中一系列的重要进程,包括叶、根、茎的生长发育,植物生长期向生育期的转变,果实的形成及成熟,信号传递,病毒防御等。
在病毒侵染植物的过程中,通常会激发寄主植物的siRNAs(small interferingRNAs)基因沉默途径来抵制病毒的入侵,而病毒则进化出沉默抑制子来抵抗siRNAs的基因沉默抑制。由于miRNAs对靶标mRNAs的调控与siRNAs介导的基因沉默途径间有着共同特性及其元件,所以病毒抑制子在扰乱siRNAs介导的基因沉默途径的同时也扰乱了miRNAs的调控,使miRNAs正常的调控途径发生紊乱,导致寄主植物正常生理过程发生改变,表现出相应的感病症状。
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和番茄不孕病毒(Tomatoaspermy virus,TAV)是影响番茄产量和品质的主要病毒。CMV与TAV具有类似的基因组结构,它们编码的2b蛋白是植物侵染过程中的主要致病因子,2b蛋白同时也是典型的沉默抑制子。在病毒侵染下,检测寄主植物的miRNAs和其靶标表达量的改变,并结合寄主植物症状的产生,来研究miRNAs表达差异与病毒致病性的关系是一种较为新颖有效的实验方法。
本研究旨在利用荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)技术,检测在CMV-Fny、敲除2b基因的CMV-FnyA2b、添加卫星的CMV-Fny-satT1和tAV-Bj四种病毒对番茄侵染下,番茄花和果实中九条不同的miRNAs:miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR167、miR168、miR171、miR172和其九条靶标基因:SPL、MYB、ARF10、DCL1、NAC1、ARF8、AGO1、SCL和AP2的表达量变化,结合寄主的症状及CMV不同株系的基因表达差异,分析CMV的卫星RNAs和2b蛋白对miRNAs途径的影响,从CMV基因组,寄主miRNAs及其靶标mRNAs表达量多重方面来探讨寄主植物症状产生的原因。
结果表明,相对于未接毒的对照植株,CMV-Fny△2b侵染的植株没有观察到感病症状,其他三种病毒侵染的的植株都表现出了明显的形态学的改变,表现为植物发育迟缓,花型畸小和果子缺陷。定量的结果显示CMV-FnyA2b侵染的植株,其miRNAs及其靶标mRNAs基本上也没有变化。而CMV-Fny、CMV-Fny-satT1和TAV-Bj侵染的植株大部分miRNAs及其靶标mRNAs都有很高的上调,但这三种病毒侵染的植株其miRNAs及靶标mRNAs表达量有明显差异,同时对寄主miRNAs调控途径的影响表现为组织特异性。另外,CMV敲除2b基因或添加卫星RNA后都下调了CMV各个基因的表达量,但CMV-Fny△2b基因组的表达量下调的尤为明显,表明了2b基因在病毒侵染过程中的重要性。对寄主番茄miRNAs和靶基因mRNAs表达量改变的研究和它们相关功能的预测,为了解番茄发育成熟过程中miRNAs介导的表形变化提供了实验参考依据。同时以病毒侵染为切入点,来研究miRNAs的差异表达,将为研究症状产生和miRNAs调控之间的关系提供新的研究视点。