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狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的一种人兽共患传染病,每年约有59000人死于狂犬病,我国是狂犬病高发国家之一。狂犬病一旦发病其致死率几乎为100%,疫苗接种是预防狂犬病的最有效方法。狂犬病疫苗在免疫后可以通过T细胞依赖和T细胞非依赖的途径激活B细胞免疫应答,从而激活机体产生中和抗体,预防狂犬病的发生。前期研究表明,白介素-21（Interleukin-21,IL-21）信号通路缺失后对RABV免疫后的抗体诱导水平产生影响,提示IL-21在RABV的免疫原性中起到重要作用。因此,为了进一步探索IL-21在RABV的免疫原性中的作用机制,本研究拟通过反向遗传操作构建表达IL-21的重组RABV,并利用体外和体内一系列实验对该重组RABV进行研究:首先,通过反向遗传学操作系统拯救表达鼠源IL-21重组RABV,命名为LBNSE-IL21,通过ELISA检测IL-21的体外表达情况,结果表明LBNSE-IL21感染BSR细胞可以表达IL-21且具有剂量依赖性;此外,LBNSE-IL21在BSR细胞和NA细胞的生长曲线与亲本毒株LBNSE几乎一致,表明外源基因IL-21的插入对病毒的增殖没有影响;在病毒致病性方面,将LBNSE-IL21脑内注射小鼠后,小鼠无明显临床症状,且体重基本保持上升趋势,与亲本毒株LBNSE体重变化曲线相似,表明IL-21的表达对致病性没有显著影响。进一步研究IL-21的表达对免疫原性的影响机制,LBNSE-IL21和LBNSE感染Balb/c小鼠,利用流式细胞术检测小鼠体液免疫应答中各类免疫细胞的变化。结果发现与LBNSE相比,LBNSE-IL21不能激活淋巴结或外周血液中的树突状细胞（dendritic cell,DC）,但可以显著提高淋巴结中滤泡性辅助细胞（follicular helper T cells,Tfh）细胞和生发中心B细胞（germinal center B,GC B）数量,表明LBNSE-IL21免疫后表达的IL-21可以促进Tfh细胞和GC B细胞的生成,影响生发中心的发育。进一步研究发现,LBNSE-IL21可以促进B细胞向浆细胞（Plasma cells,PC）的分化,在骨髓产生更多数量的长寿命浆细胞（Long-lasting Plasma cells）,从而诱导产生高水平的中和抗体。最后,为了探究LBNSE-IL21作为疫苗的免疫效果,将LBNSE-IL21和LBNSE免疫ICR小鼠,采集免疫后第1-7周的小鼠血清,利用FAVN测定中和抗体效价。检测结果显示LBNSE-IL21在免疫后第1周便快速诱导机体产生中和抗体,并且第1-6周的抗体水平均显著高于亲本毒株LBNSE。这表明LBNSE-IL21免疫后可以更快诱导机体产生高水平的中和抗体。此外,在免疫后第三周,利用脑内注射50 MICLD50的CVS-24对小鼠进行攻毒实验,最终LBNSE-IL21免疫后可提供高达92%的保护率,显著高于亲本病毒免疫保护率68%。综上所述,LBNSE-IL21免疫后可以通过促进Tfh、GC B细胞,以及浆细胞的产生,从而提高中和抗体的产生水平,提高免疫保护。因此,IL-21可作为新型狂犬病疫苗的候选者。