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牙周炎是口腔常见疾病之一，是一种以牙齿支持和连接组织丧失为特征的慢性感染性疾病，是包括菌斑在内的局部刺激因素引起的直接细胞毒作用及蛋白分解作用，以及宿主对持续存在菌斑微生物的免疫应答所引起间接损伤的结果。牙周炎病因不明，近来大量研究表明，自身免疫反应在牙周炎发生发展中发挥着重要的作用，而CD4~+T细胞，即辅助性T细胞(T helper, Th)，作为机体免疫调节中的核心细胞，在机体免疫应答中发挥着关键作用。牙周炎的全身易感因素包括遗传因素、性激素、吸烟及有关的系统性疾病等，其中关于吸烟影响牙周炎发生发展的研究较多，但其具体机制仍不明确。课题组前期研究发现在大鼠牙周组织和人牙周膜细胞(human periodontalligament cells, hPDLCs)存在烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(alpha7nicotinicacetylcholine receptor, α7nAChR)的功能性表达，尼古丁作用后，α7nAChR表达升高，这一效应可以被特异性拮抗剂α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin,α-BTX）所拮抗。另有研究表明，尼古丁、α7nAChR与CD4~+T细胞之间存在着密切的联系。这些研究为我们研究尼古丁在牙周炎发生发展中的作用提供了新的思路：尼古丁激活人牙周膜细胞膜上α7nAChR后是否会通过CD4~+T细胞进一步对牙周组织产生破坏作用？其免疫分子机制是什么？目前尚未见相关报道。本研究将深入探讨CD4~+T细胞介导的免疫调节与吸烟相关性牙周炎的密切关系，以期阐明机体的免疫应答在吸烟相关性牙周炎发生发展中发挥的作用。实验一人牙周膜细胞的体外培养及CD4~+T细胞的分选1材料与方法取因正畸减数拔除的健康无龋第一前磨牙，无菌条件下采用组织块法进行原代培养；待组织块周围爬出细胞并增殖后，常规传代，用于下一步实验。抽取健康成年非吸烟志愿者外周静脉血10ml，密度梯度离心法分离单个核细胞，CD4-FITC抗体染色，孵育，流式细胞仪分选CD4~+T细胞。2结果组织块培养约八天后，其边缘陆续有成纤维样细胞爬出，传代后显微镜下观察细胞呈长梭形，贴壁生长，轮廓清晰，排列成放射状。抽取外周血，密度梯度离心法成功分离单个核细胞，显微镜下观察，细胞形态呈圆形，在培养液中悬浮生长；CD4-FITC抗体染色，孵育，流式细胞仪分选，成功分选CD4~+T细胞：分选前，CD4~+T细胞在体系中约占33.3%，分选后，CD4~+T细胞在体系中约占98.2%。3结论体外成功培养hPDLCs，成功分选出CD4~+T细胞，建立实验所需的细胞模型。实验二尼古丁对与/不与CD4~+T细胞共培养人牙周膜细胞M-CSF、RANKL及OPG表达的影响1材料与方法选取第5代hPDLCs接种于六孔板，分别给予激动剂尼古丁（10-5M）和/或拮抗剂α-BTX（10-8M）；采用实时定量PCR和Western blot实验检测各组细胞M-CSF、RANKL和OPG的mRNA和蛋白表达情况。2结果实时定量PCR结果表明：非共培养条件下，与对照组相比，10-5M尼古丁明显上调人牙周膜细胞RANKL、M-CSF mRNA表达，明显下调OPGmRNA表达，差异有统计学意义(P<0.05)；与非共培养组相比，共培养条件下10-5M尼古丁进一步上调人牙周膜细胞RANKL mRNA表达，差异有统计学意义(P<0.05)，M-CSF、OPG mRNA表达水平与非共培养组类似，差异无统计学意义(P>0.05)；Western blot的结果表明：非共培养条件下，10-5M尼古丁明显上调人牙周膜细胞RANKL蛋白表达，明显下调OPG蛋白表达(P<0.05)；与非共培养组相比，共培养条件下10-5M尼古丁进一步上调人牙周膜细胞RANKL蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.05)，OPG蛋白表达水平与非共培养组类似，差异无统计学意义(P>0.05)。3结论PCR和Western blot的结果显示：与对照组相比，尼古丁作用后，RANKL、M-CSF的表达升高，OPG的表达降低，RANKL/OPG比值升高；与CD4~+T细胞共培养后RANKL的表达进一步升高，OPG表达水平与非共培养组类似，RANKL/OPG比值进一步升高；说明尼古丁可上调人牙周膜细胞促进破骨细胞分化细胞因子的表达，下调抑制破骨细胞分化细胞因子的表达，增强其诱导骨吸收的能力；与CD4~+T细胞共培养后，可能通过它们之间的相互作用，进一步增强其诱导骨吸收的能力。实验三尼古丁对与/不与hPDLCs共培养CD4~+T细胞迁移能力的影响1材料与方法选取状态良好的CD4~+T细胞接种于24孔板，分别给予α7nAChR激动剂尼古丁（10-5M）和/或拮抗剂α-BTX（10-8M），利用Transwell迁移小室观察尼古丁作用下CD4~+T细胞迁移能力改变。2结果Transwell迁移实验表明：非共培养条件下，与对照组相比，10-5M尼古丁明显增强CD4~+T细胞迁移能力，差异有统计学意义(P<0.05)，α-BTX+尼古丁处理组CD4~+T细胞迁移能力与对照组类似，差异无统计学意义(P>0.05)；与非共培养组相比，共培养条件下，10-5M尼古丁进一步增强CD4~+T细胞迁移能力，差异有统计学意义(P<0.05)，α-BTX+尼古丁处理组细胞迁移能力与非共培养组类似，差异无统计学意义(P>0.05)。3结论Transwell迁移实验显示：与对照组相比，尼古丁可明显增强CD4~+T细胞迁移能力；与hPDLCs共培养后，CD4~+T细胞的迁移能力进一步增强；说明尼古丁可促进CD4~+T细胞的迁移，提示可能会加重局部炎性反应，与hPDLCs共培养后，可能通过它们之间的相互作用，CD4~+T细胞的迁移能力进一步增强，进一步加重局部炎性反应，可能造成病理性损害。