STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及转染后细胞的生物学特性观察

• 作 者: 刘甲
• 机 构: 西北农林科技大学
• 出 处: 西北农林科技大学 西北农林科技大学
• 发表日期: 2008年期
• 关键词: 基因转染 基因转染乳腺上皮细胞 乳腺上皮细胞培养液 培养液重组表达质粒 重组表达质粒阳性克隆 阳性克隆增殖能力 增殖能力流式细胞术检测 流式细胞术检测转录活化因

信号转导及转录活化因子(signal and activators of transcription；STAT)是潜在的转录因子。在很多人类癌症和转化的细胞系中，活性的Stat3是阻碍细胞凋亡、促进细胞转化所必不可少的因子。近年来人们对Stat3的研究异常活跃，多项研究结果显示Star3在多种肿瘤组织与细胞系中异常表达，并与肿瘤的增殖分化、免疫逃避、血管新生、侵袭转移等密切相关。本试验将携带有Stat3基因的质粒通过脂质体转染法转入牛乳腺上皮细胞，并对其生物学特性进行研究，为生产转基因动物以及牛乳腺上皮细胞的永生化提供研究基础。
1、采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明，培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征。
2、应用PCR技术从含有人Stat3基因的质粒POTB7中扩增Star3基因。将其克隆入真核表达载体PEGFP-C1中，构建重组表达质粒。
3、用含15％血清DMEM培养液培养牛乳腺上皮细胞，通过脂质体2000将外源基因Stat3转入牛乳腺上皮细胞，用荧光显微镜观测EGFP的表达，转染24h后大约16％的细胞被导入含Stat3基因的重组表达质粒用600 μg/mL G418筛选获得阳性克隆，然后换为含300 μg/mL G418的培养液继续培养使阳性克隆得到扩增。
4、获得的阳性克隆提取RNA，设计特异性引物进行RT-PCR反应，经电泳分析在2332bp处出现目的条带，未转染的细胞无目的条带。
5、通过流式细胞术检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明，导入Stat3基因后，细胞增殖能力增强，染色体倍数发生变化，细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代，表明导入Star3基因后，能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。