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目的:运用体外试验探讨黄连素(Berberine)分别联合索拉菲尼(Sorafenib)和奥沙利铂(Oxaliplatin)对肝癌细胞增殖与凋亡的影响,为临床应用提供基础理论。研究方法:(1)细胞:人肝癌细胞株SMMC-7721,HepG2购自中国科学院上海生命科学研究所。(2)实验分组:设立空白对照组、不同浓度(5,25,50,100μM)Berberine组、不同浓度(1,2,4,8μM)Sorafenib组、不同浓度(1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50μM)Oxaliplatin组;Berberine+Sorafenib组、Berberine单药组、Sorafenib单药组、空白对照组;Berberine+Oxaliplatin组、Berberine单药组、Oxaliplatin单药组、空白对照组。(3)MTS比色法检测各干预组对SMMC-7721,HepG2人肝癌细胞的存活与生长情况的影响;结晶紫染色镜检各干预组对细胞形态、体积、密度的影响。(4)EdU细胞增殖法检测各干预组对处于S期的SMMC-772,HepG2细胞的影响。(5)集落形成实验检测各干预组对肝癌细胞增殖的影响。(6)蛋白质免疫印迹法检测各干预组诱导肝癌细胞凋亡相关蛋白表达的情况,其中有凋亡蛋白cleaved-caspase 3及cleaved-PARP或者抗凋亡蛋白Bcl-2及肿瘤血管内皮生长因子VEGF的表达。(7)统计分析:统计数据使用Graphpad Prism 6,均数±标准差的数据进行表示。多组之间的比较使用单因素方差分析法,P<0.05则表示差异有统计学意义。结果:(1)MTS比色法结果显示:与对照组比,黄连素组、索拉菲尼组、奥沙利铂组细胞存活率下降,呈浓度依赖性;与各药物单独处理组比,黄连素与索拉菲尼组、黄连素与奥沙利铂组细胞存活率显著下降,呈时间依赖性,有统计学差异(P<0.05)。结晶紫染色镜检结果也显示:镜下观察,对照组细胞体积大,性状不一,数量较多,细胞之间连接紧密;黄连素组、索拉菲尼组、奥沙利铂组细胞体积小,长梭形,细胞之间连接较稀疏;黄连素与索拉菲尼组,黄连素与奥沙利铂组细胞体积最小,长梭形或者点状,密度最稀疏。(2)EdU细胞增殖法结果显示:与对照组比,黄连素组、索拉菲尼组、奥沙利铂组细胞增殖减少(蓝色荧光、红色荧光均减少);而黄连素与索拉菲尼组和黄连素与奥沙利铂组细胞的增殖又较各自的单药组明显减少(蓝色荧光、红色荧光最少),而且联用组S期DNA复制较各单药组少。(3)集落形成实验显示:与对照组比,黄连素组、索拉菲尼组细胞形成的集落数目减少,直径减少;而黄连素+索拉菲尼组形成的集落数目、直径又较各自的单药组明显减少。(4)蛋白免疫印迹法显示黄连素与索拉菲尼组和黄连素与奥沙利铂组凋亡蛋白cleaved-PARP,cleaved-caspase 3蛋白表达较对应的黄连素组,索拉菲尼组,奥沙利铂组明显增多,而且黄连素与索拉菲尼组抗凋亡蛋白Bcl-2,血管形成因子VEGF均比各自的对应的单药组减少。结论:(1)黄连素和索拉菲尼单用或者联用可抑制人肝癌细胞SMMC-7721,HepG2的生长及诱导其发生凋亡。黄连素和奥沙利铂单用或者联用均可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长增殖及诱导其发生凋亡。(2)黄连素分别与索拉菲尼和奥沙利铂联用时,抑制人肝癌细胞增殖的效果较各单药组明显。并且随着药物作用时间延长,黄连素与索拉菲尼组,黄连素与奥沙利铂组抑制人肝癌细胞的生长较各黄连素组,索拉菲尼组,奥沙利铂组之间的更明显。SMMC-7721细胞无论是对中成药单体黄连素还是对化疗药索拉菲尼,奥沙利铂都较HepG2更加敏感,存活率更低。(3)黄连素与索拉菲尼组,黄连素与奥沙利铂组较各单药组更能诱导人肝癌细胞发生凋亡,可能通过Caspase级联反应,而黄连素与索拉菲尼组诱导凋亡通路还可能与抗凋亡蛋白Bcl-2的减少,抑制血管形成因子VEGF有关。