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近年来，随着免疫缺陷宿主的不断增多，临床上深部真菌感染率大幅上升，已成为免疫功能低下患者死亡的主要原因之一。白念珠菌（Candida albicans）作为人类的条件致病性真菌，越来越受到人们的重视。
液泡是真菌细胞中降解大分子，储存营养物质以及耐受外界压力的细胞器。真菌细胞液泡具有哺乳动物细胞溶酶体功能之外的其他功能。白念珠菌液泡对菌丝生长和致病力至关重要。液泡主要通过提高白念珠菌对压力的耐受能力及促进菌丝生长两个方面帮助白念珠菌发挥其致病性。因此，研究真菌液泡相关基因功能有助于筛选抗真菌的新化合物以及寻找抗真菌化合物新靶点。
本课题选取ORF19.3222等5个基因，通过同源重组的方法构建其双臂缺失菌，采用Spot Assay,激光共聚焦显微镜，体内生存率实验等分析表型，考察基因功能，从而推测Orf19.3222p等是否为影响白念珠菌液泡及相关功能的重要蛋白，及其经何种途径影响液泡功能，最终帮助白念珠菌发挥致病性。
实验主要方法为:His1-Leu2-Arg4基因敲除策略构建ORF19.3222、ORF19.6950、ORF19.6605、ORF19.2006、ORF19.5780单臂缺失菌、双臂缺失菌及回复菌。套式PCR法鉴定各菌构建成功。Spot assay实验考察各基因缺失菌对多种刺激的敏感性，包括pH刺激、氧化刺激、各种临床抗菌药刺激、金属离子刺激、细胞壁损伤相关药物刺激、渗透刺激，亚硫酸盐刺激和DNA损伤刺激。考察在10％胎牛血清，Spider及Lees培养基中各缺失菌菌丝形成能力，在RPMI1640培养基中观察被膜形成能力。利用微量液基稀释法及抑菌曲线检测双臂缺失菌对唑类药物的敏感性。通过FM4-64，DCFDA染色后于激光共聚焦显微镜下观察各基因缺失菌液泡的形态，插入GFP荧光标记后于激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在细胞中的定位，Rhodamine phalloidin染色后于激光共聚焦显微镜下观察各基因缺失菌细胞骨架。利用CPY水解酶活性检测液泡功能。
结果表明ORF19.3222基因缺失菌对氧化刺激，细胞壁损伤相关药物刺激、渗透刺激、亚硫酸盐刺激等表现出敏感，对唑类药物表现出耐受，ORF19.6950、ORF19.6605、ORF19.2006、ORF19.5780等基因缺失菌与亲本菌表型无显著差异;ORF19.3222基因缺失菌在10％胎牛血清、Spider及Lees培养基中菌丝形成能力下降，其余基因缺失菌与亲本菌无显著差异;FM4-64，DCFDA染色后激光共聚焦显微镜检显示各基因缺失菌液泡的形态保持完好。故此，本课题就ORF19.3222基因做更深一步的研究。利用生长曲线和流式细胞术实验，我们证实该基因缺失菌生长周期较亲本菌增长，提示该基因可能促进细胞生长;FM4-64染色后在各时间点激光共聚焦显微镜检显示，ORF19.3222基因缺失菌细胞内吞速率在60min内较亲本菌缓慢，提示ORF19.3222基因可能促进白念珠菌细胞早期内吞过程;小鼠体内生存率实验中，ORF19.3222基因缺失菌注射的小鼠24h后，肝脏富集菌量与亲本菌无明显差异，但肾脏富集菌量显著下降，小鼠死亡率明显下降，提示该基因缺失菌毒力减弱。CPY水解酶活性检测实验中，ORF19.3222基因缺失菌的CPY水解酶活性下降，与亲本菌SN152有显著性差异，提示ORF19.3222基因有助于维持液泡CPY水解酶活性。
综上所述，我们得出以下结论:ORF19.3222基因不会破坏白念珠菌液泡形态，但可以维持液泡CPY水解酶的活性，维持液泡内吞功能。该基因可以提高白念珠菌对唑类药物的敏感性，降低对过氧化氢、羟基脲、荧光白、刚果红、两性霉素B、氯化钠、氯化锂、氯化钾、布雷菲德菌素A和甘油的敏感性。ORF19.3222基因可以促进白念珠菌菌丝及生物被膜形成，帮助白念珠菌生长及发挥致病性。Orf19.3222p是定位在白念珠菌液泡膜上的蛋白，该蛋白可能与亚硫酸盐外排相关。进一步研究该基因功能为寻找抗真菌化合物新靶点奠定理论基础。