论文部分内容阅读
本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 膜融合是一种重要的生命现象，参与多种细胞活动，包括细胞融合，囊泡转运，细胞器的动态变化以及病毒感染。几乎所有这些活动都是由一类特殊的膜蛋白——膜融合蛋白（也称为融合原）所介导的。广为熟知的融合蛋白是介导囊泡融合的SNARE复合物，在过去二十年中其作用机制已经得到深入揭示。另一种重要的融合事件是包膜病毒的融合，这是由病毒融合蛋白所介导的。病毒融合蛋白定位在病毒的包膜上，控制病毒感染的关键步骤——病毒包膜与宿主细胞膜的融合。 不同的融合蛋白诱导膜融合的物理过程基本相同，但具体机制却大不相同。与SNARE复合物不同，病毒融合蛋白的构象复杂得多，这也决定了其融合机制更为复杂。在本研究中，关注水泡型口炎病毒的融合蛋白G蛋白的跨膜区在融合中的作用机制。构建了一套新的细胞-细胞融合系统，方便对VSV G介导的融合时间进行实时监控以及定量分析。根据这套实验系统，发现VSV G能够在1-2min的时间内迅速介导细胞融合。为了研究跨膜区的功能，将VSV G的跨膜区替换成了其他融合蛋白的跨膜区。结果显示跨膜区的替换会显著降低VSV G的融合效率及其介导的慢病毒感染效率。由于VSV G的胞外结构域并未改变，仅是其跨膜区被替代，推测G蛋白仍能正常起始融合过程，但是融合可能会被阻断在半融合状态，而不能进一步完成完全融合。为了验证假设，构建了另一套细胞-细胞融合实验系统。发现跨膜区的替换能够将融合事件阻断在半融合阶段。最后，对VSV G跨膜区中影响融合的关键氨基酸进行了筛选，并指出VSV G跨膜区在融合中的作用具有序列依赖性。 本研究中，发现VSV G的跨膜区对于其融合能力至关重要。跨膜区替换后融合过程被阻断在了半融合阶段。研究工作为以后融合机制的研究提供了一些新的研究策略，更重要的是为抗病毒预防和治疗提供新的靶点。 第二部分 硒是人体所必需的微量元素，对身体健康、肿瘤的预防以及治疗都有重要作用。大量证据表明，超营养剂量的硒能够诱导包括前列腺癌，膀胱癌，甲状腺癌，食管肝癌，结肠癌，肺癌以及白血病等多种肿瘤细胞的凋亡。因此，研究亚硒酸钠诱导白血病细胞凋亡的分子机制可以为含硒药物的研发以及白血病的治疗提供理论依据，并具有重要意义。 本课题以白血病NB4细胞为研究对象，研究亚硒酸钠抑制NB4细胞保护性自噬和诱发细胞凋亡的分子机制。首先通过免疫荧光实验以及电镜观察验证了超营养剂量的亚硒酸钠处理NB4细胞后，自噬发生显著下调，采用流式细胞术分析也证实的前面的结果，即亚硒酸钠诱导细胞凋亡。在对细胞内活性氧水平进行检测后，发现亚硒酸钠处理后活性氧水平显著上调，在活性氧清除剂处理后亚硒酸钠对自噬的抑制作用得以逆转。因此推测亚硒酸钠对自噬的抑制作用与活性氧的有关。 进一步的机制研究发现亚硒酸钠诱导的活性氧对自噬的抑制是由ULK1的下调介导的。通过ChIP实验证明p-p53(Ser392)对ULK1进行转录调节。而在对p53的激酶进行筛查后发现p70S6K可以使p53Ser392位磷酸化进而调控ULK1表达，实现对自噬的控制。免疫荧光以及IP实验同样证实了p70S6K与p53之间的确存在相互作用。至此，实验结果证明亚硒酸钠诱导的活性氧能够通过抑制p70S6K/p53/ULK1通路抑制保护性自噬，诱导细胞凋亡。