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精液与雄性生殖疾病密切相关,近年来,蛋白质组学的出现为精液研究提供了新的有效的研究方法。迄今为止,蛋白质组学已运用在人、鼠等多种动物的精液研究中,促进了精子发生分子机理的认识和雄性生殖疾病治疗。本研究主要在实验室前期研究的基础上,对水牛精液进行更为深入的研究,进一步优化水牛精液蛋白质组学体系,为后续的差异蛋白质组学提供良好的技术支撑。此外,分离鉴定高、低活力水牛精子之间以及高畸形率、正常精子之间的表达差异蛋白,为理解活力低下、形态异常的机制奠定理论基础。第一章：通过比较IPG胶条的长度、线性或非线性、上样量、SDS-PAGE胶浓度、纯化蛋白的方法等参数,优化水牛精子蛋白双向电泳蛋白质组学体系。试验结果显示,用丙酮沉淀法纯化蛋白,上样量350μg,并使用24cmpH3-10NL IPG胶条,浓度12.5%的SDS-PAGE胶进行双向电泳,能获得了分辨率高、质量更好的含有约500多个蛋白点的水牛精子蛋白2-DE图谱。第二章：运用已优化的双向电泳技术体系分离高、低活力水牛精子蛋白,使用ImageMaster2.0软件比较分析两者2-DE图谱,并结合基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和生物信息学鉴定差异蛋白点。本章试验建立了高、低活力的水牛精子差异蛋白表达的2-DE图谱,并筛选得到18个差异蛋白点,其中有5个蛋白点在低活力的水牛精子中表达下调,8个表达上调,1个缺失,4个在高活力水牛精子中缺失。最终,质谱成功鉴定了其中4个,分别对应3种蛋白：精子尾部结构蛋白2、α-ATP合成酶、α-琥珀酰辅酶A合成酶。精子尾部结构蛋白2、α-AYP合成酶在低活力精子中表达下调,α-琥珀酰辅酶A合成酶表达上调,这些差异点可能与精子活力相关。第三章与第二章的试验方法一致。本章试验建立了高畸形率、正常水牛精子蛋白双向电泳差异蛋白表达谱,并筛选得到16个表达差异明显的蛋白点,其中5个蛋白点在畸形率高的水牛精子中表达量上调,6个表达量下调,3个缺失,2个在正常水牛精子中缺失。并运用质谱成功鉴定了6个,分别对应4种蛋白：左旋天冬酰胺酶、热应激蛋白、半乳糖激酶、β-微管蛋白。左旋天冬酰胺酶、热应激蛋白、半乳糖激酶在畸形率高的水牛精子上表达量上调,β-微管蛋白表达量则下降。这些差异点与精子结构、代谢等有关,可能与精子形态结构异常相关联。第四章试验主要通过对比不同上样量,进一步优化水牛精浆双向电泳体系,并使用质谱技术鉴定部分水牛精浆蛋白。结果表明,300μg的上样量优于200μg和300μg,使用300pg上样量于非线性的24cm pH3-10的IPG胶条,获得了蛋白点500多个的水牛精浆2-DE图谱。质谱鉴定103个丰度相对较高的水牛精浆蛋白点,最终27个被成功鉴定,分别对应15种蛋白：血清白蛋白、血清转铁蛋白、T-复合蛋白1-β、磷酸甘油酸激酶、山梨醇脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶、肌动蛋白、锌α2糖蛋白、过敏原Bosd2、牛精清蛋白-30kDa、过氧化还原酶-5、附睾分泌蛋白E1、溶菌酶c-3、核糖核酸酶、磷酸变位酶。综上所述,本研究进一步优化了水牛精子和精浆蛋白双向电泳技术体系,为差异蛋白质组学研究奠定了良好的技术基础。此外,鉴定分析高、低活力水牛精子之间以及高畸形率、正常水牛精子之间的差异表达蛋白信息,有利于理解精子活力低下、形态结构异常的分子机制并为找到与精子活力、形态相关的分子标记物提供线索。