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在羊毛工业、禽类市场及理发行业每年可产生数百万吨富含角蛋白的生物材料。为了避免角蛋白生物材料资源浪费，通常采用化学法从人发、羽毛和羊毛等天然生物材料中提取角蛋白进行回收利用。人发角蛋白因来源于人类而不具有异源性和排异反应，且还原法提取得到的人发角蛋白具有良好的水溶性，并具有止血及伤口愈合功能。因此，对人发角蛋白的提取方法及角蛋白生物功能的进一步研究具有重要的意义和价值。
人发角蛋白提取组分的复杂性，导致角蛋白提取过程中反应机理的研究难以进行。在提取过程中除二硫键断裂外，对角蛋白的化学变化了解甚少，阻碍了角蛋白提取技术的发展。鉴于此，本课题首次提出通过DNA重组技术获取单一的人发重组角蛋白，并对重组角蛋白依照还原提取的方法进行还原，通过对比重组角蛋白还原前后的理化性质，阐明角蛋白提取过程中的化学变化，初步探究人发角蛋白的还原提取机制。此外，本课题也对角蛋白提取物和重组角蛋白还原前后的降解性、生物相容性和组织修复效果进行了比较和评价。
主要研究内容和结论如下：
1.基于人发角蛋白的分类，本课题分别选择了一种Ⅰ型角蛋白37和一种Ⅱ型角蛋白81进行表达获得重组角蛋白Recombinant Keratin37（RK37）和Recombinant Keratin81（RK81），按照还原提取法对其进行还原处理获得了水溶性的重组角蛋白Soluble Recombinant Keratin37（SRK37）和Soluble Recombinant Keratin81（SRK81），并通过还原提取法从人发中得到了角蛋白提取物（Keratin extract）。对以上5种角蛋白进行理化检测分析结果如下：①接触角测量结果显示，重组角蛋白RK37和RK81经还原后其接触角分别从38.2°和42.9°减小到24.6°和30.6°，亲水性显著提升；②二硫键和巯基测定结果显示，还原后RK37和RK81的二硫键含量分别从3.30和1.09mol/105g降低到1.23和0.66mol/105g，巯基含量分别从0.04和0.02mg/mL增加到0.09和0.04mg/mL。说明还原过程中角蛋白的二硫键断裂约50%；③FT-IR结果表明角蛋白还原处理前后的化学结构没有发生明显改变；④TGA结果显示SRK37和SRK81的热稳定性降低；⑤SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS的结果表明RK37和RK81经还原后分子量降低；⑥氨基酸分析结果显示，还原处理后重组角蛋白的总氨基酸含量降低，从RK37和RK81的93.3和91.9g/100.0g分别降至54.1和50.0g/100.0g。其中，胱氨酸和精氨酸等氨基酸含量降低，说明除了二硫键断裂外，在角蛋白的提取过程中发生了氨基酸的反应，导致重组角蛋白的分子量降低；⑦CD图谱显示重组角蛋白的二级结构主要由α-螺旋组成；BeStSel分析可知重组角蛋白还原后的α-螺旋含量增加，无规卷曲含量降低，表明氨基酸的反应主要发生在无规卷曲区域。
2.对5种角蛋白的降解性和生物相容性进行了评价。实验结果显示：5种角蛋白材料均可降解。各角蛋白对细胞无毒性且能促进细胞增殖，有良好的细胞相容性。角蛋白材料植入部位没有出现动物器官损伤病变，未引起动物体内促炎症因子异常表达，各角蛋白具有良好的生物相容性。
3.为了满足临床上对修复材料保湿性、透气性和安全性的需求，采用冻融法制备了角蛋白复合羧甲基纤维素（CMC）水凝胶材料，并对水凝胶材料的理化性质进行了分析。通过SD大鼠皮肤全切层创伤模型对各水凝胶材料的组织修复效果进行了评价。结果显示：各水凝胶材料呈均匀的多孔结构，SRK37/CMC，SRK81/CMC和Keratin extract/CMC组具有更高的空隙率、溶胀性和持水性。Haematoxylin Eosin（HE）染色和Masson’s Trichrome（MTC）染色结果显示，水溶性角蛋白复合水凝胶可以更快地促进血管新生、表皮形成和创伤部位胶原的合成。此外，将水溶性角蛋白（SRK37，SRK81和Keratin extract）分别与CMC按不同比例（1:3，1:5，1:7）制备成复合水凝胶的组织修复结果显示，随着各水溶性角蛋白含量的增加，伤口愈合速率加快。
综上，角蛋白还原提取过程中除了发生二硫键的断裂外，在蛋白结构的无规卷曲区域还发生了氨基酸的反应，使得角蛋白的分子量降低。还发现重组角蛋白经还原后亲水性提升，热稳定性降低。还原提取过程中角蛋白的二硫键约断裂了50%。以上发现为角蛋白提取机制的深入探讨奠定了理论基础。此外，与重组角蛋白和角蛋白提取物相比，还原后水溶性重组角蛋白在体内表现出更强的伤口愈合能力，同时也具备良好的生物相容性，可为新型组织修复材料的设计与开发提供参考。
人发角蛋白提取组分的复杂性，导致角蛋白提取过程中反应机理的研究难以进行。在提取过程中除二硫键断裂外，对角蛋白的化学变化了解甚少，阻碍了角蛋白提取技术的发展。鉴于此，本课题首次提出通过DNA重组技术获取单一的人发重组角蛋白，并对重组角蛋白依照还原提取的方法进行还原，通过对比重组角蛋白还原前后的理化性质，阐明角蛋白提取过程中的化学变化，初步探究人发角蛋白的还原提取机制。此外，本课题也对角蛋白提取物和重组角蛋白还原前后的降解性、生物相容性和组织修复效果进行了比较和评价。
主要研究内容和结论如下：
1.基于人发角蛋白的分类，本课题分别选择了一种Ⅰ型角蛋白37和一种Ⅱ型角蛋白81进行表达获得重组角蛋白Recombinant Keratin37（RK37）和Recombinant Keratin81（RK81），按照还原提取法对其进行还原处理获得了水溶性的重组角蛋白Soluble Recombinant Keratin37（SRK37）和Soluble Recombinant Keratin81（SRK81），并通过还原提取法从人发中得到了角蛋白提取物（Keratin extract）。对以上5种角蛋白进行理化检测分析结果如下：①接触角测量结果显示，重组角蛋白RK37和RK81经还原后其接触角分别从38.2°和42.9°减小到24.6°和30.6°，亲水性显著提升；②二硫键和巯基测定结果显示，还原后RK37和RK81的二硫键含量分别从3.30和1.09mol/105g降低到1.23和0.66mol/105g，巯基含量分别从0.04和0.02mg/mL增加到0.09和0.04mg/mL。说明还原过程中角蛋白的二硫键断裂约50%；③FT-IR结果表明角蛋白还原处理前后的化学结构没有发生明显改变；④TGA结果显示SRK37和SRK81的热稳定性降低；⑤SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS的结果表明RK37和RK81经还原后分子量降低；⑥氨基酸分析结果显示，还原处理后重组角蛋白的总氨基酸含量降低，从RK37和RK81的93.3和91.9g/100.0g分别降至54.1和50.0g/100.0g。其中，胱氨酸和精氨酸等氨基酸含量降低，说明除了二硫键断裂外，在角蛋白的提取过程中发生了氨基酸的反应，导致重组角蛋白的分子量降低；⑦CD图谱显示重组角蛋白的二级结构主要由α-螺旋组成；BeStSel分析可知重组角蛋白还原后的α-螺旋含量增加，无规卷曲含量降低，表明氨基酸的反应主要发生在无规卷曲区域。
2.对5种角蛋白的降解性和生物相容性进行了评价。实验结果显示：5种角蛋白材料均可降解。各角蛋白对细胞无毒性且能促进细胞增殖，有良好的细胞相容性。角蛋白材料植入部位没有出现动物器官损伤病变，未引起动物体内促炎症因子异常表达，各角蛋白具有良好的生物相容性。
3.为了满足临床上对修复材料保湿性、透气性和安全性的需求，采用冻融法制备了角蛋白复合羧甲基纤维素（CMC）水凝胶材料，并对水凝胶材料的理化性质进行了分析。通过SD大鼠皮肤全切层创伤模型对各水凝胶材料的组织修复效果进行了评价。结果显示：各水凝胶材料呈均匀的多孔结构，SRK37/CMC，SRK81/CMC和Keratin extract/CMC组具有更高的空隙率、溶胀性和持水性。Haematoxylin Eosin（HE）染色和Masson’s Trichrome（MTC）染色结果显示，水溶性角蛋白复合水凝胶可以更快地促进血管新生、表皮形成和创伤部位胶原的合成。此外，将水溶性角蛋白（SRK37，SRK81和Keratin extract）分别与CMC按不同比例（1:3，1:5，1:7）制备成复合水凝胶的组织修复结果显示，随着各水溶性角蛋白含量的增加，伤口愈合速率加快。
综上，角蛋白还原提取过程中除了发生二硫键的断裂外，在蛋白结构的无规卷曲区域还发生了氨基酸的反应，使得角蛋白的分子量降低。还发现重组角蛋白经还原后亲水性提升，热稳定性降低。还原提取过程中角蛋白的二硫键约断裂了50%。以上发现为角蛋白提取机制的深入探讨奠定了理论基础。此外，与重组角蛋白和角蛋白提取物相比，还原后水溶性重组角蛋白在体内表现出更强的伤口愈合能力，同时也具备良好的生物相容性，可为新型组织修复材料的设计与开发提供参考。