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核桃(Juglans regia)因富含多种营养物质越来越受到欢迎，但是因核桃及含核桃食品感染致病菌而引起的疾病爆发事件越来越多。这些致病菌可在核桃中长期存活，一旦环境条件合适便会迅速繁殖。核桃的食用安全关系着人们的健康，因此需要对核桃进行杀菌研究。作为一种相对新颖的热处理方法，射频加热已被广泛用于农产品的杀菌研究。射频处理可在保持产品品质的同时满足杀菌要求。但关于采后核桃表面微生物的分布情况、核桃的射频杀菌方法及杀菌机制等缺乏系统的研究。
本研究以核桃为对象，主要进行了核桃的射频杀菌方法及机制等研究。具体研究内容包括：(1)选择不同地区及不同贮藏期的核桃，利用高通量测序技术检测核桃表面存在的主要细菌类型以及是否存在致病菌属；(2)选择合适的目标菌，利用加热板系统进行不同温度、不同水分活度及不同加热速率条件下致病菌的热致死动力学研究；(3)通过表征细胞结构变化及利用转录组测序技术来探究不同水分活度和加热速率对目标菌耐热性的影响机制；(4)采用射频处理对核桃进行杀菌验证及检测贮藏期间目标菌存活和核桃品质的变化；(5)利用表观试验与转录组测序技术结合的方法，从细胞水平到基因水平系统揭示射频加热对目标菌的杀灭机制。主要结果如下：
(1)基于细菌16SrRNA的V4高变区，利用高通量测序(HTS)技术对核桃表面的细菌多样性进行检测。结果表明不同地区和贮藏期核桃表面的细菌类型相似，但是相对丰度却不相同。Proteobacteria、Cyanobacteria、Firmicutes和Actinobacteria在门水平上占主导地位；在科水平上，Enterobacteriaceae占主导地位；属水平上存在一些条件致病菌属，并且在样品中检测到潜在致病的葡萄球菌属。核桃中检测到的微生物物种与土壤、水和一些田间作物相似，说明核桃在收获及加工处理期间会受到外界环境的污染。
(2)利用加热板系统(HBS)比较三株代表菌在核桃壳粉中的耐热性，选出最耐热的菌株进行不同温度、不同水分活度和不同加热速率下的热致死动力学研究。结果表明金黄色葡萄球菌ATCC25923的耐热性在三种菌株中最强。相同温度下，金黄色葡萄球菌ATCC25923的D值随着水分活度的增加而降低。当加热速率大于等于1℃/min(1、5和10℃/min)时，金黄色葡萄球菌ATCC25923的D值无显著差异(P＞0.05)。当加热速率小于1℃/min(0.2和0.5℃/min)时，金黄色葡萄球菌ATCC25923的D值随着加热速率的降低而增加。在加热速率为0.1℃/min条件下，金黄色葡萄球菌ATCC25923的降低量在升温期间(从26℃升到56℃)达到将近2.91(±0.1)logCFU/g。金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量在44℃到50℃升温期间降低的很少，可能是菌体产生了耐热蛋白。在非等温加热条件下，Weibull模型(R2=0.97-0.99)比线性模型(R2=0.88-0.98)更适合拟合金黄色葡萄球菌ATCC25923的灭活曲线。
(3)通过扫描电镜、亚致死损伤检测和转录组测序技术探究水分活度和加热速率对金黄色葡萄球菌ATCC25923耐热性的影响机制。结果表明热处理后金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞完整性遭到破坏，高水分活度样品中细胞损伤更严重。由转录组分析可知差异基因主要富集在转录调节、能量代谢、细胞膜转运、细胞膜和细胞壁生物合成等代谢通路。转录组分析表明，金黄色葡萄球菌ATCC25923在低水分活度条件下通过抑制细胞膜功能相关的代谢并刺激细胞壁的合成来抵御外部损伤。在低加热速率条件下，金黄色葡萄球菌ATCC25923的能量代谢通路中基因的表达全部受到抑制，表明其通过降低自身代谢速率达到存活的目的。
(4)建立一种核桃的射频杀菌方法，并检测加速贮藏期间核桃品质及金黄色葡萄球菌ATCC25923的存活研究。结果表明核桃水分含量的增加会导致射频加热均匀性变差，辅助热风、搅拌及保温的措施可显著提高核桃的射频加热均匀性。射频处理的最佳工艺为：用70℃的热风辅助射频加热，在16.0cm的极板间距下将核桃加热到70℃，期间搅拌三次(每隔3min)，之后将极板间距调至19.0cm，在运行射频系统30s，然后关闭1min的模式循环下保温40min，最后将核桃放成单层进行14min的强制风冷却。在最佳射频处理工艺下进行核桃的射频杀菌验证，可将金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量降低4log以上，满足杀菌要求。射频处理后样品的过氧化值(PV)和脂肪酸(FA)值略高于对照样品，但是二者之间无显著差异(P＞0.05)且在坚果行业要求的可接受范围内(PV＜1.0meq/kg和FA＜0.6%)。在20天的加速贮藏试验中，处理组和对照组之间的PV和FA值无显著差异，但是两者的PV值均有所增加且在贮藏20天后PV值大于1meq/kg。另外，射频处理组样品的L*值与对照样品之间无显著性差异。在30℃、30%相对湿度和30℃、65%相对湿度的贮藏条件下，对照组及射频处理组中金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量在前4天大幅度下降，随后对照组中金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量逐渐趋于平稳。射频处理后核桃中金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量逐渐降低至检测限(1log/nut)，而且在整个贮藏期间，金黄色葡萄球菌ATCC25923没有增长趋势。
(5)通过扫描电镜、亚致死损伤检测、胞外ATP检测及转录组测序技术探究射频加热对金黄色葡萄球菌ATCC25923的杀灭机制。结果表明射频处理后金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞完整性遭到破坏，射频加热时间越长，破坏程度越大。由转录组分析结果可知，射频处理后的差异基因涉及的代谢通路包括核酸代谢、翻译、能量代谢、细胞膜转运、细胞膜和细胞壁生物合成。转录组分析表明金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞壁和细胞膜是射频处理主要的作用位点。射频处理通过抑制细胞壁的合成并扰乱细胞膜转运功能破坏金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞完整性。同时，射频加热导致金黄色葡萄球菌ATCC25923的翻译活性及能量代谢受到影响，最终导致菌体死亡。
本研究以核桃为对象，主要进行了核桃的射频杀菌方法及机制等研究。具体研究内容包括：(1)选择不同地区及不同贮藏期的核桃，利用高通量测序技术检测核桃表面存在的主要细菌类型以及是否存在致病菌属；(2)选择合适的目标菌，利用加热板系统进行不同温度、不同水分活度及不同加热速率条件下致病菌的热致死动力学研究；(3)通过表征细胞结构变化及利用转录组测序技术来探究不同水分活度和加热速率对目标菌耐热性的影响机制；(4)采用射频处理对核桃进行杀菌验证及检测贮藏期间目标菌存活和核桃品质的变化；(5)利用表观试验与转录组测序技术结合的方法，从细胞水平到基因水平系统揭示射频加热对目标菌的杀灭机制。主要结果如下：
(1)基于细菌16SrRNA的V4高变区，利用高通量测序(HTS)技术对核桃表面的细菌多样性进行检测。结果表明不同地区和贮藏期核桃表面的细菌类型相似，但是相对丰度却不相同。Proteobacteria、Cyanobacteria、Firmicutes和Actinobacteria在门水平上占主导地位；在科水平上，Enterobacteriaceae占主导地位；属水平上存在一些条件致病菌属，并且在样品中检测到潜在致病的葡萄球菌属。核桃中检测到的微生物物种与土壤、水和一些田间作物相似，说明核桃在收获及加工处理期间会受到外界环境的污染。
(2)利用加热板系统(HBS)比较三株代表菌在核桃壳粉中的耐热性，选出最耐热的菌株进行不同温度、不同水分活度和不同加热速率下的热致死动力学研究。结果表明金黄色葡萄球菌ATCC25923的耐热性在三种菌株中最强。相同温度下，金黄色葡萄球菌ATCC25923的D值随着水分活度的增加而降低。当加热速率大于等于1℃/min(1、5和10℃/min)时，金黄色葡萄球菌ATCC25923的D值无显著差异(P＞0.05)。当加热速率小于1℃/min(0.2和0.5℃/min)时，金黄色葡萄球菌ATCC25923的D值随着加热速率的降低而增加。在加热速率为0.1℃/min条件下，金黄色葡萄球菌ATCC25923的降低量在升温期间(从26℃升到56℃)达到将近2.91(±0.1)logCFU/g。金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量在44℃到50℃升温期间降低的很少，可能是菌体产生了耐热蛋白。在非等温加热条件下，Weibull模型(R2=0.97-0.99)比线性模型(R2=0.88-0.98)更适合拟合金黄色葡萄球菌ATCC25923的灭活曲线。
(3)通过扫描电镜、亚致死损伤检测和转录组测序技术探究水分活度和加热速率对金黄色葡萄球菌ATCC25923耐热性的影响机制。结果表明热处理后金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞完整性遭到破坏，高水分活度样品中细胞损伤更严重。由转录组分析可知差异基因主要富集在转录调节、能量代谢、细胞膜转运、细胞膜和细胞壁生物合成等代谢通路。转录组分析表明，金黄色葡萄球菌ATCC25923在低水分活度条件下通过抑制细胞膜功能相关的代谢并刺激细胞壁的合成来抵御外部损伤。在低加热速率条件下，金黄色葡萄球菌ATCC25923的能量代谢通路中基因的表达全部受到抑制，表明其通过降低自身代谢速率达到存活的目的。
(4)建立一种核桃的射频杀菌方法，并检测加速贮藏期间核桃品质及金黄色葡萄球菌ATCC25923的存活研究。结果表明核桃水分含量的增加会导致射频加热均匀性变差，辅助热风、搅拌及保温的措施可显著提高核桃的射频加热均匀性。射频处理的最佳工艺为：用70℃的热风辅助射频加热，在16.0cm的极板间距下将核桃加热到70℃，期间搅拌三次(每隔3min)，之后将极板间距调至19.0cm，在运行射频系统30s，然后关闭1min的模式循环下保温40min，最后将核桃放成单层进行14min的强制风冷却。在最佳射频处理工艺下进行核桃的射频杀菌验证，可将金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量降低4log以上，满足杀菌要求。射频处理后样品的过氧化值(PV)和脂肪酸(FA)值略高于对照样品，但是二者之间无显著差异(P＞0.05)且在坚果行业要求的可接受范围内(PV＜1.0meq/kg和FA＜0.6%)。在20天的加速贮藏试验中，处理组和对照组之间的PV和FA值无显著差异，但是两者的PV值均有所增加且在贮藏20天后PV值大于1meq/kg。另外，射频处理组样品的L*值与对照样品之间无显著性差异。在30℃、30%相对湿度和30℃、65%相对湿度的贮藏条件下，对照组及射频处理组中金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量在前4天大幅度下降，随后对照组中金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量逐渐趋于平稳。射频处理后核桃中金黄色葡萄球菌ATCC25923的数量逐渐降低至检测限(1log/nut)，而且在整个贮藏期间，金黄色葡萄球菌ATCC25923没有增长趋势。
(5)通过扫描电镜、亚致死损伤检测、胞外ATP检测及转录组测序技术探究射频加热对金黄色葡萄球菌ATCC25923的杀灭机制。结果表明射频处理后金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞完整性遭到破坏，射频加热时间越长，破坏程度越大。由转录组分析结果可知，射频处理后的差异基因涉及的代谢通路包括核酸代谢、翻译、能量代谢、细胞膜转运、细胞膜和细胞壁生物合成。转录组分析表明金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞壁和细胞膜是射频处理主要的作用位点。射频处理通过抑制细胞壁的合成并扰乱细胞膜转运功能破坏金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞完整性。同时，射频加热导致金黄色葡萄球菌ATCC25923的翻译活性及能量代谢受到影响，最终导致菌体死亡。