基于深度测序技术的蓝藻多样性及功能基因研究

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蓝藻水华已成为世界范围内的重大环境问题之一。近年来,我国湖泊富营养化日益严重,伴随的蓝藻水华的暴发也越来越频繁。为了有效治理蓝藻水华,我们必须先弄清水体中蓝藻的种类及组成。许多蓝藻具有固氮能力,蓝藻束毛藻曾被认为是海洋中的主要固氮微生物。本研究主要依据深度测序技术,选择蓝藻相应的功能基因,通过大量的序列数据来研究蓝藻在不同水体、不同环境中的多样性、类群组成及动态变化。主要研究内容和研究结果总结如下:  1.选择了内陆七个典型湖泊,包括洱海、太湖、鄱阳湖、陆水水库、东钱湖、东湖和龙虎泡。选择了不同季度、不同水层、不同位点、底泥疏浚前后的65份环境水样,使用454深度测序的方法,对样品DNA中的蓝藻特异藻蓝蛋白PC-IGS基因进行扩增和序列测定,得到568245条高质量序列,包括59835条单一序列,测序深度分布为4470-15110条。基于95%的核酸相似度划分得到5497个OTU,样品稀释曲线趋于平缓,且总体覆盖度达到99.02%。所有OTU经过4470次重取样标准化后,计算各样品内部的Shannon,Chao1,ACE,和Simpson多样性指数。结合Genbank数据库中的参考序列,构建分子系统树来区分不同的蓝藻类群,得到样品中蓝藻类群的组成结构。使用统计学方法来研究蓝藻类群在四个季节中的组成与动态变化以及不同湖泊中蓝藻组成的差异等。结果表明,基于蓝藻蛋白PC-IGS构建的分子系统树总体上可以区分不同的蓝藻类群;所选湖泊中蓝藻群落主要是微囊藻属、聚球藻属、鱼腥藻/束丝藻类群和拟柱胞藻/尖头藻类群组成,微囊藻在大多数样品中占绝对优势,鱼腥藻/束丝藻类群次之。洱海和太湖的表层样品中,不同位点的蓝藻组成存在显著性差异;鄱阳湖样品中蓝藻组成随着水位的高低变化明显,微囊藻与鱼腥藻/束丝藻类群交替成为优势种;陆水水库样品中,春夏季蓝藻组成相似,而冬季的变化较大;湖泊疏浚对东钱湖蓝藻组成的影响较大,疏浚之后,蓝藻群落中的微囊藻、鱼腥藻/束丝藻、拟柱胞藻/尖头藻类群的比例明显减少或者消失,样品中聚球藻类群占绝对优势;东湖两个位点中优势蓝藻类群分别为微囊藻类群和鱼腥藻/束丝藻类群,优势类群在越冬期(10月-次年1月)变化不大;蓝藻群落结构的分子方差分析表明,洱海、太湖、东钱湖、陆水水库四个湖泊具有特异性,与其他湖泊均存在显著性差异。  2.选择了我国南海中7个位点,包括珠江口、台湾海峡、吕宋海峡、菲律宾西岸束毛藻水华点、大陆架位点及两个开阔海域位点。通过2007年到2010年间四次海洋调查,采集了27个表层(200m以上)水样。使用454测序的方法,对水样DNA中的固氮酶相关nifH基因序列进行扩增和序列测定,一共得到217599条高质量序列,包括16967条单一序列,推导出5172条蛋白序列,样品测序深度为5289~13343。结果表明,南海潜在固氮生物的多样性相对太平洋、大西洋海域低,而且主要由γ-变形菌和蓝藻束毛藻类群组成。单细胞蓝藻类群UCYN-A和UCYN-B以及与硅藻共生的蓝藻植生藻的比例很低。不同年份、不同季度和不同位点之间的固氮生物群落组成无显著性差异,但是不同深度之间存在显著性差异。表层样品中固氮生物组成相似,而中下表层样品中则差异较大。  3.分离了一株无异形胞但具固氮能力,含伪空胞蛋白的鞘丝藻藻株Lyngbyahieronymusii CHAB3367,并对其进行了全基因组测序。测序结果经过拼接后得到185个框架序列,基因组大小为6.84 Mb,N50为101181 bp,GC含量为41.8%。基因预测分析得到6543个基因,包括6499个编码基因,39个tRNA和5个rRNA基因。其中3184个基因有GO注释结果,2190个基因有KEGG注释结果。Lyngbyahieronymusii CHAB3367含有有完整的固氮相关基因簇,而且序列非常保守。通过与现存的两株海洋鞘丝藻基因组的比较发现,3367含有921个特有的功能基因,这些基因多与糖类代谢、DNA修饰相关。Lyngbya hieronymusii CHAB3367的伪空胞基因簇与微囊藻之间存在水平基因转移现象。
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