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猕猴属于旧大陆猴的一个种系,是STLV-1和SRV-1两种逆转录病毒的天然宿主。这两种病毒的存在不仅会影响猴群的生存质量,而且会危害饲养人员及实验人员的身体健康。因此,无论从建立合格的灵长类实验动物种群考虑,还是从实验动物福利入手,或是考虑到实验人员和饲养人员的身体健康,都有必要对猴群中这两种可能存在的逆转录病毒进行定期监测。本次实验目的就是要建立一种快速、灵敏度和准确性高、以及经济节约型的能同时检测猕猴STLV-1和SRV-1两种逆转录病毒的多重PCR方法,用于猕猴种群逆转录病毒的常规监测。
首先,运用DNAMAN核苷酸分析软件对NCBI-GenBank中已登记的SRV-1各亚型全基因序列进行比对,寻找其保守序列;同样方法对STLV-1各亚型全基因序列进行比对,寻找其保守序列。然后对所得到的两种病毒的保守序列进行分析,避开同源性高的区域进行引物设计。最后选定的区域分别为两种逆转录病毒膜蛋白的env基因区。引物设计采用Primerpremier软件和Omiga分析软件,并参考相应的文献,最终确定引物序列。实验中通过优化、调整PCR循环条件和反应体系,最终建立起了能同时扩增出这两种逆转录病毒的多重PCR检测体系。对PCR产物进行胶回收、测序,运用CLUSTALW和Omiga序列分析软件对其进行比对,以确定其正确性。
按照年龄段对我们要检测的猕猴种群进行分类,随机取样。首先运用免疫荧光法(IFA)对来自云南省丽江市、思茅市野生猕猴以及中国医学科学院医学生物学研究所自繁猕猴共168只进行了两种逆转录病毒的初筛,然后运用上述已建立的多重PCR方法进行确认。SRV-1和STLV-1两种逆转录病毒抽样检查结果显示我们的猴子中这两种逆转录病毒的感染率较低。