论文部分内容阅读
研究目的:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是以不可逆性气流受限为特征的慢性肺部疾病,其中吸烟是其主要的致病因素。发病率、死亡率的不断上升以及治疗手段上的不足给国家甚至世界带来较大的经济负担。细胞疗法已被用于多种疾病的治疗,本实验进行探究过表达趋化因子受体4(CXC chemokine receptor type 4,CXCR4)的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能否通过抑制细胞凋亡延缓COPD细胞凋亡模型的建立。研究方法:1.通过BMSCs的塑料依附性对SD大鼠的BMSCs进行提取以及纯化。2.取纯化至P3代的BMSCs进行骨诱导分化、脂诱导分化、软骨诱导分化等检测细胞的分化潜能,以及通过流式细胞技术检测细胞表面分子。3.通过逆转录病毒转染技术诱导BMSCs过表达CXCR4蛋白,并通过定量即时聚合酶连锁反应技术(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)以及免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测BMSCs的CXCR4基因以及蛋白的表达4.香烟烟雾(Cigarette Smoke,CS)暴露法构建COPD肺组织细胞凋亡模型,72只大鼠随机分成4个组,分别为正常对照组、CXCR4-BMSCs细胞移植组(下述简称CXCR4-BMSCs组)、pBABE-BMSCs细胞移植组(下述简称pBABE-BMSCs组)、模型组。在模型构建过程中,每个月进行两次体内移植BMSCs治疗。并于每个月取一部分大鼠的肺组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色并检测肺泡平均线性截距(Mean linear intercept,MLI)、WB检测肺组织中凋亡蛋白的表达以及TUNEL实验检测凋亡细胞的分布以及凋亡量。结果:1、经分离以及纯化所得细胞可被诱导成骨、成脂、成软骨分化,流式细胞检测细胞表面分子CD90(阳性率为97.15%),CD29(阳性率为97.36%),CD45(阳性率0.62%),CD34(阳性率0.43%),结果显示符合BMSCs的特征。2、逆转录病毒转染诱导BMSCs过表达CXCR4蛋白,经qRT-PCR检测显示CXCR4基因成功整合至BMSCs基因组中,并且CXCR4-BMSCs组细胞CXCR4蛋白表达量较pBABE-BMSCs组明显增加(组间差异有统计学意义,p<0.01)。3、持续CS的暴露可造成肺泡间隔断裂:模型组随CS的暴露时间延长,肺泡MLI增加,第三个月模型组肺泡MLI较第一个月明显增加且差异有统计学意义(p<0.05)。第三个月内组间比较,对照组、CXCR4-BMSCs组肺泡MLI较模型组小,差异存在统计学意义(对照组p<0.01,CXCR4-BMSCs组p<0.05);pBABE-BMSCs组肺泡MLI亦比模型组小,但差异无统计学意义(p>0.05)。4、凋亡蛋白的表达:第3个月组间凋亡蛋白的表达存在显着差异。与对照组相比,模型组中Cleaved Caspase 8,Cleaved Caspase3和Cleaved PARP-1的凋亡蛋白均显着增加(p<0.05);CXCR4-BMSCs组凋亡蛋白表达量较模型组均明显降低(p<0.05),pBABE-BMSCs组与模型组相比仅凋亡蛋白Cleaved Caspase 8表达量存在差异且差异有统计学意义(p<0.05),余凋亡蛋白量存在差异,但无明显统计学意义(p>0.05)。5、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端标记测定法(Terminal dexynucleotidyl transferase mediated Deoxyuracil nucleoside triphosphate nick end labeling,TUNEL)检测肺组织细胞凋亡结果:以肺泡实质细胞凋亡为主,通过统计分析,对照组、CXCR4-BMSCs组细胞凋亡率均比模型组小,差异存在统计学意义(p<0.01)。pBABE-BMSCs组细胞凋亡率亦比模型组小,差异存在统计学意义(p<0.05)。结论:本实验能够通过体外增殖纯化获得BMSCs,并且通过逆转录病毒转染技术构建过表达CXCR4的BMSCs。在COPD细胞凋亡模型建立的过程中,过表达CXCR4的BMSCs能够通过抑制细胞凋亡,减少凋亡蛋白的表达量从而延缓疾病的进展。