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随着化学农药的广泛使用，昆虫抗药性问题已经成为害虫防治的主要问题。大量研究表明，杀虫剂作用靶标的基因突变导致敏感性下降是害虫抗药性形成的重要机制，但还没有真正阐明其内在的机理和提出应对的策略。而且大多数研究集中在果蝇、家蝇和尖音库蚊这些病原传媒害虫以及棉蚜、棉铃虫、桃蚜等农业害虫中。由于家蚕具有丰富的遗传资源、良好的研究基础和日益积累的基因组信息，本文开展了家蚕神经靶点基因的克隆工作，并在此基础上通过对序列的比对分析，以期在基因水平获得更多关于这些靶点作用机理和害虫抗药性形成机制的信息和证据并服务于重要的农林业害虫防治。本研究结合家蚕基因组数据库，采用分子克隆与RACE技术相结合的方法，成功地在家蚕中克隆获得乙酰胆碱酯酶(GenBank No.EF52189)、乙酰胆碱受体α亚基(GenBank No.EF521820)、GABA-门控氯离子通道α亚基基因的全长cDNA序列(GenBank No.EF521821)，以及钠离子通道α亚基的部分cDNA序列(GenBank No.EF521818)。结合前人已经报道的这些相关基因序列，进行蛋白序列比对以及系统树的构建，分析了两型AChE蛋白序列之间的差异和聚类关系，以及其他靶点基因同源保守性。在此基础上，对家蚕乙酰胆碱脂酶基因构建了pET41b-AChE原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了该基因，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中呈现为一条约100kDa的包含His和GST tag的融合蛋白，可溶性分析结果表明，表达的AChE蛋白以包涵体形式存在。主要研究内容及结果包括：
⑴针对原核表达体系会形成包涵体而影响表达产物活性的问题，在昆虫杆状病毒表达体系中同时构建了家蚕乙酰胆碱受体和GABA门控氯离子通道α亚基基因的供体质粒pFAsTBAC-HTa-AChR和pFASTBAC-HTa-GABA，构建好的质粒转到DH10BAC中，挑取白色菌落再划一次板，得到的阳性克隆进行Bacmid抽提，获得Bacmid-AChR和Bacmid-GABA，分别用靶基因Bacmid转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Tn-5细胞得到重组病毒，用重组病毒感染Tn-5细胞进行蛋白表达，收集细胞进行SDS-PAGE检测。在SDS-PAGE检测结果中，用Bacmid—AChR和Bacmid-GABA转染的细胞中分别表达获得家蚕的AChR和GABA门控氯通道α亚基的蛋白产物，证明插入的目的基因得到有效表达。
⑵为了将家蚕研究结果在鳞翅目昆虫研究中加以利用，选择生产上危害严重的斜纹夜蛾作为主要目标害虫来研究增加外界调节因素对斜纹夜蛾生理及基因表达方面的影响。在激素调控系统中主要针对植物源性杀虫剂印楝素及其作用机理进行了初步研究。首先通过兼并引物克隆了该物种中一段600bp的蜕皮激素受体(Ecdysone Receptor，EcR)基因片段，根据这段序列信息设计基因特异性引物，分析了印楝素处理斜纹夜蛾卵巢细胞后，对该基因表达的抑制和调节作用，发现印楝素影响细胞正常贴壁生长，随着处理浓度的增加，悬浮漂移细胞的比例也增加，而且高浓度处理会引起细胞溶解而死亡。
⑶针对EcR的dsRNA进行EcR RNAi实验，研究中发现在斜纹夜蛾三龄幼虫中注射EcR-dsRNA，对EcR基因的干扰和沉默会导致部分个体化蛹过程受阻。实验中发现两个特殊的表型，一个只有尾部三体节发育为蛹期特征而其他体节均为幼虫形态的不正常个体；另一个出现背腹发育不同步现象，背部呈现蛹期虫态特征，而腹部仍保持幼虫期的形态。在另一组注射EcR-dsRNA以后通过浸叶法添食不同浓度的印楝素，在10ppm处理组存活的13个个体中有6个出现特异表型，其中两个幼虫为不完全蜕皮，尾部体节无法蜕皮导致发育受阻；另外发现4个供试虫体发育至五龄时出现腹足缺失表型，其中有两个是腹足几乎全部缺失，腹足应该生长的部位只有少数几个突起，没有发育成形的腹足；一个出现左侧腹足完全缺失，右侧第二腹足缺失表型；另一个个体只缺失了左侧最后一个腹足。由此推测EcR可能参与变态发育过程中组织生成的时间和空间的级联调控，而印楝素的介入可能打乱了这一过程而导致在幼虫蜕皮变态过程中部分组织发育不正常而产生畸形。