P2Y12/P2Y13受体激活促进培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞炎症因子合成及释放的实验研究

• 作 者: 刘培雯
• 机 构: 遵义医学院
• 出 处: 遵义医学院
• 发表日期: 2017年期
• 关键词: P2Y受体 小胶质细胞 IL-1β IL-6 TNF-α

在脊髓背角分布有很多小胶质细胞,当感觉传导通路受到外界伤害性刺激,可以迅速做出反应,分泌出一些疼痛相关的炎症因子。在这个过程中,许多神经递质受体和细胞内的蛋白激酶都发挥了作用。在大鼠脊髓背角小胶质细胞,表达有嘌呤P2Y₁₂和P2Y₁₃受体,文献报道其在脊髓参与神经痛的发生。在坐骨神经结扎、脊神经结扎和糖尿病疼痛大鼠,均可见背角P2Y₁₂和P2Y₁₃受体表达升高,P38MAPK磷酸化增强。然而,小胶质细胞P2Y₁₂和P2Y₁₃受体激活与炎症因子之间的关系,还有待实验求证。因此,本实验采用离体培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞,应用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）及酶联免疫吸附（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）技术,观察:（1）背角小胶质细胞P2Y₁₂/P2Y₁₃受体激活与炎症因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的合成及释放的关系。（2）背角小胶质细胞P2Y₁₂/P2Y₁₃受体激活后影响这三种炎症因子合成及释放的信号通路。该研究有助于我们进一步理解嘌呤受体和炎症因子在脊髓参与神经痛的调节的内在机制。目的:1.阐明大鼠脊髓背角小胶质细胞P2Y₁₂、P2Y₁₃受体激活后是否促进炎症因子IL-1β、IL-6以及TNF-α合成及释放。2.大鼠脊髓背角小胶质细胞P2Y₁₂/P2Y₁₃受体激活促进IL-1β、IL-6以及TNF-α合成及释放的胞内信号通路。方法:1.培养并纯化新生SD乳鼠（<3d）脊髓背角小胶质细胞,以5×105/孔的细胞密度均匀接种于12孔板,培养48 h。实验分组:（1）空白对照组,加入单纯DMEM高糖培养基;（2）ADPβS处理组,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3h;（3）MRS2395处理组,MRS2395（10μmol/L）预处理20 min,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3h;（4）MRS2211处理组,MRS2211（10μmol/L）预处理20 min,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3h;（5）MRS2395和MRS2211联合处理组,MRS2395（10μmol/L）+MRS2211（10μmol/L）预处理20 min,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3 h。RTFQ-PCR技术检测ADPβS（10μmol/L,3h）作用下小胶质细胞Iba-1、IL-1β、IL-6和TNF-α在m RNA水平表达的变化;ELISA技术检测ADPβS（10μmol/L,3h）作用下小胶质细胞IL-1β、IL-6和TNF-α释放的变化。2.高纯度小胶质细胞以5×105/孔的密度接种于12孔板,培养48 h。实验分组:（1）空白对照组,加入单纯DMEM高糖培养基;（2）ADPβS处理组,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3 h;（3）Y-27632（ROCK活性抑制剂）处理组,Y-27632（10μmol/L）预处理1h,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3 h;（4）SB203580（P38MAPK磷酸化抑制剂）处理组,SB203580（20μmol/L）预处理2h,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3 h;（5）PDTC（NF-κB信号抑制剂）处理组,PDTC（20μmol/L）预处理4 h,加入ADPβS（10μmol/L）,作用3h。RTFQ-PCR技术检测不同药物对ADPβS（10μmol/L,3h）刺激小胶质细胞IL-1β、IL-6和TNF-α在m RNA水平表达的影响;ELISA技术检测不同药物对ADPβS（10μmol/L,3h）刺激小胶质细胞IL-1β、IL-6和TNF-α释放的变化。结果:1.ADPβS（1μmol/L）作用3h后,Iba-1在m RNA水平表达明显升高,与正常对照相比,具有统计学意义（P﹤0.01）;ADPβS（10μmol/L）作用3h后,Iba-1在m RNA水平表达明显升高,与正常对照相比,具有统计学意义（P﹤0.01）;MRS2395（10μmol/L）或MRS2211（10μmol/L）预先孵育20min可部分抑制ADPβS（10μmol/L）诱发的背角小胶质细胞Iba-1 m RNA表达升高,与ADPβS组相比,均具有统计学意义（P﹤0.05）。MRS2395（10μmol/L）与MRS2211（10μmol/L）联合预处理则几乎全部阻断ADPβS诱发的背角小胶质细胞Iba-1 m RNA表达升高,与ADPβS组相比,具有统计学意义（P﹤0.01）。2.与空白对照组相比,ADPβS（10μmol/L）作用3h后,IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达明显升高,均具有统计学意义（P﹤0.01）;MRS2395（10μmol/L）或MRS2211（10μmol/L）预先孵育20min均可部分抑制ADPβS诱发的这些效应,与ADPβS组相比,均具有统计学意义（P﹤0.05）。MRS2395（10μmol/L）与MRS2211（10μmol/L）联合预处理则几乎全部阻断ADPβS诱发的这些效应,与ADPβS组相比,具有统计学意义（P﹤0.01）。3.与空白对照组相比,ADPβS（10μmol/L）作用3h后IL-1β、IL-6和TNF-α释放明显增多（P﹤0.01）,均具有统计学意义;MRS2395（10μmol/L）或MRS2211（10μmol/L）预先孵育20min可部分抑制ADPβS诱发的这些效应,与ADPβS组相比,均具有统计学意义（P﹤0.05）。MRS2395（10μmol/L）与MRS2211（10μmol/L）联合预处理则几乎全部阻断ADPβS诱发的这些效应,与ADPβS组相比,具有统计学意义（P﹤0.01）。4.与空白对照组相比,ADPβS（10μmol/L）明显促进IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达上调（P﹤0.01）,此效应可以分别被Y-27632（10μmol/L）预处理1h、SB203580（20μmol/L）预处理2h、PDTC（20μmol/L）预处理4h阻断,与ADPβS组相比,具有统计学意义（Y-27632:P﹤0.05;SB203580:P﹤0.05;PDTC:P﹤0.01）。5.与空白对照组相比,ADPβS（10μmol/L）明显促进脊髓背角小胶质细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α（P﹤0.01）,此效应可以分别被Y-27632（10μmol/L）预处理1h、SB203580（20μmol/L）预处理2h、PDTC（20μmol/L）预处理4h可以阻断ADPβS诱发的这些效应,与ADPβS组相比,具有统计学意义（Y-27632:P﹤0.05;SB203580:P﹤0.05;PDTC:P﹤0.01）。结论:1.P2受体激动剂ADPβS作用下,脊髓背角小胶质细胞激活,Iba-1m RNA表达上调,此效应主要由P2Y₁₂和P2Y₁₃受体介导。2.ADPβS作用下,脊髓背角小胶质细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α在m RNA水平表达上调,而且IL-1β、IL-6和TNF-α释放增加,这些效应主要由P2Y₁₂和P2Y₁₃受体介导。3.P2Y₁₂和P2Y₁₃受体促进炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达及释放可能是通过ROCK/P38MAPK/NF-κB信号通路。