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番茄曲叶病是近年来在广东番茄上新发生的一种病毒病，每年均给番茄生产造成较大损失。广东番茄曲叶病毒(Tobmato leaf curl Guangdong virus，ToLCGDV)是引起该病害的病原病毒之一。
本研究室此前已经对广东番茄曲叶病毒G2分离物的基因组进行了克隆和序列分析，明确了该病毒分离物的基因组为单组份，仅含DNA-A，其全长为2744 nt；在其编码的6个ORFs中，AC4基因与其它菜豆金色花叶病毒属病毒的同源率变异最大。本研究通过分析AC4基因在ToLCGDV致病过程中的作用，明确该基因的功能，为进一步解析其遗传变异的病理学意义，进而开展该病害的控制对策研究奠定基础。为此，本研究进行了如下的工作：
1.应用菜豆金色花叶病毒属病毒通用简并引物AV494/DeP3，对网室中保存的番茄曲叶病样进行PCR检测，均能成功地扩增到570 bp的特异片段，说明这些番茄植株中存在菜豆金色花叶病毒属病毒；进一步用ToLCGDV-[G2]特异引物TC/TD进行PCR检测，上述病样中均可扩增到1.0 kb的特异片段，说明保存的这些毒源样本确实都是由ToLCGDV-[G2]侵染引起的。
2.根据G2分离物的基因组DNA-A序列，设计了用于扩增全长序列的相邻反向引物对PG2FL-X/F与PG2FL-X/R、以及用于扩增0.7倍DNA-A(0.7A)的引物对PG2FL-S/F与PG2FL-X/R，并利用同义密码突变在引物的两端引入双元植物表达载体pBinPLUS上所具有的酶切位点，分别PCR扩增获得2744 bp的全长DNA-A和1906 bp的0.7A片段，将两者均分别克隆至中间载体上，获得重组质粒pGEM-DNA-A和pMD-0.7A。先将pMD-0.7A经Sal I和Xba I双酶切，切下的0.7A插入pBinPLUS上，得到pBinPLUS-0.7A；再将pGEM-DNA-A经Xba I酶切，切下的：DNA-A插入pBinPLUS-0.7A上，获得1.7倍基因组的侵染性克隆pBinPLUS-1.7A。测序结果证明载体构建过程中并未发生变异。将该侵染性克隆通过农杆菌介导分别接种番茄、本生烟、普通烟和三生烟，接种20天后，植株出现明显的曲叶、皱缩、叶脉突起等症状；应用通用简并引物AV494/DeP3和特异引物TC/TD对显症植株进行PCR检测，均能扩增到预期的目的条带。证明所构建的ToLCGDV侵染性克隆pBinPLUS-1.7A具有侵染能力，能在番茄、本生烟和普通烟上转录、翻译、自主复制并完成系统侵染，并产生曲叶症状；同时证实了仅有DNA-A组份能够引起寄主植物产生明显的曲叶症状。
3.根据G2分离物AC4基因的序列，设计引物对PAC4-HindⅢ/F与PAC4-PstI/R，PCR扩增获得该基因，将该序列片段插入pGEM-T，得到pGEM-AC4；再用HindⅢ和Pst Ⅰ双酶切，切下的AC4片段插入到pBinPLUS上，构建了该基因的植物表达载体pBinPLUS-AC4。采用农杆菌渗透的方法，将pBinPLUS-AC4与35S：GFP共同感染转绿色荧光蛋白GFP基因的本生烟(Nicotiana benthamiana line16c)，GFP基因的表型观察结果表明，AC4基因具有抑制局部RNA沉默的作用。
4.农杆菌介导的接种试验结果表明，AC4基因的植物表达载体pBinPLUS-AC4单独接种本生烟和番茄时，可导致接种植株产生叶片向下卷曲的症状；而pBinPLUS-AC4与pBinPLUS-1.7A混合接种本生烟和番茄时，AC4基因能够在一定程度上加重接种植株的曲叶症状。这些结果说明，AC4基因参与了ToLCGDV诱导寄主植物症状表现，是ToLCGDV的致病因子之一。