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目的:索拉非尼是中晚期肝细胞癌(HCC)的标准一线治疗药物,但在许多HCC患者中均发现了对索拉非尼的获得性耐药,导致预后不良。越来越多的证据表明,肝癌干细胞(LCSCs)参与了肝癌索拉非尼耐药过程。研究发现炎症因子白介素6(IL-6)在肝癌索拉非尼耐药中发挥作用。但是,LCSCs中IL-6参与HCC索拉非尼耐药的机制尚不清楚。我们旨在建立稳定的索拉非尼耐药肝癌细胞株,并从中分离肝癌干细胞,对IL-6/STAT3信号通路进行阻断,通过体外细胞实验和体内动物实验探究IL-6/STAT3信号通路靶向肝癌干细胞对索拉非尼耐药HCC的调控机制。方法:(1)体外细胞培养人肝癌细胞株PLC/PRF/5,细胞培养基中加入索拉非尼实验用药,使用浓度梯度法建立稳定的耐药索拉非尼肝癌细胞株PLC/PRF/5-R,CCK-8法检测PLC/PRF/5-R细胞活力,并计算IC50。利用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测PLC/PRF/5-R中的多药耐药基因(MDR)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达量,并进行比较,明确PLC/PRF/5-R对索拉非尼耐药的稳定性,以及耐药株的上皮-间质转化(EMT)特征。(2)根据已知的肝癌干细胞表面标记物分子(Ep CAM和CD44),利用流式细胞仪分选分离了PLC/PRF/5和PLC/PRF/5-R中的阳性(Ep CAM+/CD44+)和阴性(Ep CAM-/CD44-)细胞,并进行体外培养,检测细胞增殖和细胞凋亡,检测分选后阳性、阴性细胞的裸鼠皮下成瘤能力,确定耐药索拉非尼肝癌细胞株LCSCs-R分选分离及培养的成功,以进行后续实验。(3)实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测LCSCs和LCSCs-R中IL-6、IL-6R、STAT3和GP130的表达情况,以明确IL-6/STAT3信号通路在LCSCs-R中的活化状态。通过质粒介导的细胞瞬时转染IL-6R-sh RNA于LCSCs-R中,并利用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测IL-6/STAT3信号通路中的关键因子IL-6受体(IL-6R)的表达水平,以明确IL-6/STAT3信号通路被阻断。再分析测定LCSCs标记物(Ep CAM、CD44)、干性标记物(Oct3/4、β-catenin)和肝细胞分化标记物(G-6-P、AFP)的表达情况,并与对照组比较分析。(4)动物实验:通过慢病毒介导的细胞转染IL-6R-sh RNA于LCSCs-R中,构建稳定的阻断IL-6的LCSCs-R细胞系,并建立裸鼠皮下移植瘤模型,监测成瘤裸鼠在阻断IL-6和/或索拉非尼干预下的一般情况及移植瘤体积大小,实验周期结束后对瘤体组织中的LCSCs标记物(Ep CAM和CD44)、干性标记物(Oct3/4和β-catenin)和血管生成因子(VEGF和VEGFR)的蛋白表达水平进行检测,评估IL-6在肝癌索拉非尼耐药中的作用。结果:成功建立稳定的索拉非尼耐药HCC细胞株PLC/PRF/5-R,IC50为12.18μM,MDR表达升高、E-cadherin减少或缺失以及Vimentin表达增加,表现出明显的EMT特征。流式细胞仪分选后的阳性和阴性细胞的细胞增殖、细胞凋亡检测无明显的统计学差异,但裸鼠成瘤实验结果提示从PLC/PRF/5-R中分离出的耐药LCSCs比对照组LCSCs的致瘤性更强。耐药LCSCs中IL-6、IL-6R、STAT3和GP130的表达明显升高,表明IL-6/STAT3信号通路在LCSCs-R中的呈活化状态。阻断IL-6表达,恢复了耐药LCSCs对索拉非尼的敏感性,提示IL-6/STAT3信号通路在诱导索拉非尼耐药中发挥了关键作用。最后,裸鼠皮下移植瘤模型显示IL-6的下调提高了索拉非尼的抗肿瘤作用。结论:LCSCs在索拉非尼耐药HCC中发挥重要作用,抑制IL-6/STAT3信号通路可提高索拉非尼在体内外的抗肿瘤作用。这些发现表明LCSCs中IL-6可能是对抗HCC索拉非尼耐药的新靶点。