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牙槽骨是上下颌骨包绕支持牙根的部分,是牙周组织的重要组成部分,对牙体发生、发育、萌出和稳定支持起着至关重要的作用。牙槽骨组织结构与身体其它部分骨骼相似,主要由矿化的骨基质和骨细胞构成,并按其解剖部位分为固有牙槽骨、密质骨、松质骨。牙槽骨内细胞数量及类型丰富,含有如骨髓间充质干细胞,成骨细胞,骨细胞以及破骨细胞等,因此具有良好的可塑性,是人体骨骼中改建最活跃的部分。牙槽骨在应力作用下的骨改建是正畸治疗牙齿移动的生物学基础,然而在受到外伤,不良咬合力,细菌和炎症因子持续刺激时,牙槽骨很容易吸收丧失,从而导致牙齿松动或脱落。由于目前关于牙槽骨吸收的治疗并不理想,因而促进牙槽骨形成是牙周组织再生研究领域备受关注的问题。骨组织在整个生命过程中持续不断地自我更新与修复,成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收通过互相调节和反馈维持着骨代谢平衡,这一平衡被打破会导致各种骨代谢疾病发生甚至功能障碍。因此成骨细胞和破骨细胞的增殖和功能分化是维系骨代谢平衡的关键,大量研究也证实,这个平衡受到一系列生物学因素调控。骨形成是一系列相互作用、相互诱导的复杂过程。骨髓中间充质细胞在促成骨因素诱导下分化为成骨细胞前体细胞,前成骨细胞在趋化因素影响下迁移到骨形成位置并分化为成骨细胞,成骨细胞分化过程中通过分泌细胞外基质蛋白和胶原蛋白形成类骨质,类骨质中钙盐持续沉积使其矿化为骨质。成骨细胞被包埋在骨陷窝中成为骨形成作用相对静止的骨细胞,骨细胞虽然成骨效应减弱,但在骨质中通过分泌细胞因子影响着破骨细胞的分化和功能活性,从而调节骨代谢平衡。由此可知,成骨细胞凭借其合成分泌骨基质蛋白和促骨基质矿化能力,在维持骨组织稳定性和完整性中具有重要作用。因此,研究成骨细胞增殖分化相关调控因素及其分子机制是骨代谢性疾病和骨组织工程中的研究热点。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞,成骨细胞的生长和分化过程可分为前体细胞增殖、细胞外基质合成分泌、基质成熟和矿化几个阶段。各种调节因素通过信号通路将胞外信号转导至胞核内转录因子,进而调控成骨细胞各分化阶段特异性基因表达。随着成骨分化研究的日益深入,我们知道细胞成骨分化不仅受表观遗传、信号通路、转录因子和蛋白翻译的调控,也受转录后调控因子的调节。随着微小RNA(microRNA,miRNA)研究的蓬勃发展,microRNA在成骨分化中的作用越来越受到重视。microRNA是一类长度约为20个核苷酸的小分子非编码RNA,它广泛存在于各类生物体中,可以通过碱基配对与靶基因mRNA识别并结合,使其蛋白质翻译受阻或mRNA降解,从而实现在转录后水平上对靶基因mRNA的调控。miRNA表达具有时间特异性和空间特异性,其靶基因可能是关键的生长因子、细胞因子、转录因子等细胞增殖分化相关基因,因此,miRNA在生长发育,组织器官分化和疾病发生转归等各种生物学过程的调控中占有重要地位。大量研究也证实miRNA在调节细胞功能方面具有重要作用,如细胞增殖与分化、合成与分泌、衰老与凋亡甚至恶性细胞的迁移与侵袭等。同样的,多项研究证明miRNA在骨骼发育及骨代谢性疾病中起着重要作用,一系列miRNA通过其具有抑制或激活成骨分化功能的靶基因,实现对成骨分化时间和过程的调控。虽然各个具体的miRNA在成骨分化中扮演的角色不同,但Dicer作为miRNA生成所必需的关键酶在成骨分化中的作用仍鲜有报道。微小RNA前体(pre-microRNA,pre-miRNA)在Dicer酶作用下生成成熟microRNA,结合至RNA诱导沉默复合物,特异性识别并剪切同源mRNA靶基因,使其蛋白翻译阻遏。因此,研究Dicer在成骨分化中的表达变化有助于我们认识成骨分化中miRNAs作为一个整体其表达的组织特异性。目的第一部分:探讨成骨分化过程中Dicer及相关基因表达变化为后续实验提供依据。第二部分:研究Dicer在成骨分化过程中表达上调的具体调控机制。第三部分:探讨Dicer在细胞成骨分化中的作用并明确其作用机制。第四部分:明确miR-21a-5p/PTEN在Dicer调控细胞成骨分化中的作用及可能的信号转导机制。方法第一部分:小鼠前成骨细胞MC3T3-E1常规培养或成骨培养基诱导细胞分化,免疫荧光标记检测Runx2和Dicer在细胞成骨分化中的表达和细胞内定位。成骨分化诱导培养13天,Realtime-PCR观察成骨相关基因Runx2,ALP,OSX,OCN,OPN,PTEN以及Dicer,pre-miRNA21和miR-21a-5p在该细胞分化过程中随时间变化的趋势。分别于成骨诱导分化2天、4天、6天提取细胞总蛋白,western-blot检测Dicer、β-catenin、Runx2和PTEN蛋白表达变化。第二部分:分别转染Runx2过表达质粒和Runx2-siRNA干扰片段上调或敲低转录因子Runx2表达,观察Runx2表达变化对Dicer酶表达的影响。通过生物信息学分析,预测Dicer启动子区域的Runx2转录因子结合位点。构建含有小鼠Dicer基因启动子片段的荧光素酶报告基因质粒pGL-Dicer promoter,采用双荧光素酶报告基因检测分析Runx2对Dicer启动子的调控功能活性。在此基础上,应用染色质免疫共沉淀检测成骨分化过程中活细胞内转录因子Runx2与Dicer启动子的直接结合情况。第三部分:转染si Dicer pool片段干扰Dicer表达。观察Dicer对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化能力的影响。常规连续培养7天,cck8法检测Dicer干扰下调后MC3T3-E1细胞增殖能力的变化。Dicer干扰后成骨诱导培养7-14天,碱性磷酸酶和茜素红染色观察成骨细胞碱性磷酸酶合成及矿化能力的变化。成骨诱导培养4,6,8天,磷酸苯二钠法检测成骨细胞合成及分泌的ALP活性。采用Realtime-PCR检测成骨相关标志基因表达差异。最后,通过western-blot明确在常规培养、成骨诱导培养以及Dicer干扰下调后成骨诱导分化的MC3T3-E1细胞中Dicer、Runx2、PTEN和β-catenin蛋白表达变化第四部分:采用siRNA干扰Dicer表达,并转染miR-21a-5p mimics或加入PTEN抑制剂VO-OHpic trihydrate。通过碱性磷酸酶染色和Realtime-PCR检测成骨相关标志基因mRNA表达变化以观察细胞成骨分化表型变化。Western-Blot检测Dicer、PTEN以及PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子如Akt,GSK3β和β-catenin的表达及磷酸化水平变化,以探讨在细胞成骨分化过程中Runx2启动Dicer转录上调后对下游miRNA及其靶基因和信号通路产生的影响。结果第一部分:免疫荧光发现Dicer在成骨分化中表达增高,主要位于胞浆区。Realtime-PCR和western-blot结果可见发现成骨标志基因在分化过程中的表达趋势与文献报道基本一致,提示MC3T3-E1细胞成骨分化诱导模型建立是可靠的,同时上述成骨分化标志基因的表达趋势结果为本研究后续实验如选择采样时间点提供了依据。Dicer在成骨分化过程中表达增高,且与Runx2表达趋势一致,提示Dicer在成骨分化过程中的表达与作用可能与Runx2相关。成骨分化过程中miR-21a-5p表达逐渐增加,而PTEN表达有所降低,提示miR-21a-5p/PTEN的转录后调控作用可能参与了调节细胞成骨分化。第二部分:实验发现过表达Runx2导致Dicer,OCN,OPN和OSX mRNA表达上调,其中Dicer,OSX表达升高具有剂量依赖性;相反siRNA干扰Runx2导致ALP,OSX,OCN和OPN不同程度表达下调。实验以小鼠Dicer基因从转录起始位点(transcription start site,TSS)开始上游2000bp的范围(104753952-104751952)作为待研究启动子区。通过Jasper和Promoter 2.0 Prediction Server预测工具,在该范围找到4个可能的Runx2结合位点,均位于Dicer基因TSS上游1500bp以内,强烈提示Runx2对Dicer转录的潜在调节。构建含Dicer基因启动子片段的p GL-Dicer promoter质粒。将过表达质粒p CMV-Runx2与报告基因质粒p GL-Dicer promoter共转染HKK293细胞和MC3T3-E1细胞,双荧光素酶报告基因检测发现在HEK293细胞中Runx2可有效激活Dicer启动子的转录活性,且这一作用具有剂量依赖性;在MC3T3-E1细胞中siRNA干扰Runx2可抑制Dicer启动子的转录活性,证实了Dicer启动子区域包含Runx2转录所需的结合位点并具有转录激活功能。最后,染色质免疫共沉淀实验证实MC3T3-E1细胞成骨分化中,Runx2与Dicer启动子直接结合增加,提示Runx2可以直接调控Dicer在成骨分化过程中的表达。第三部分:实验通过si Dicer pool干扰下调成骨细胞中Dicer表达。cck8法检测细胞增殖活性发现Dicer下调对细胞增殖可能有一定促进作用。碱性磷酸酶和茜素红染色以及碱性磷酸酶活性测定,发现si Dicer使成骨细胞分化能力受到抑制。同时Realtime-PCR结果提示si Dicer干扰后的成骨细胞在成骨诱导分化1-5天中成骨相关基因ALP,OSX,Runx2,OCN及OPN表达均较对照组细胞显著下调。Western-blot结果同时发现si Dicer导致Runx2和β-catenin蛋白量降低,PTEN蛋白量增加,提示Dicer也可能直接或间接影响Runx2在成骨分化中的表达,且可能通过影响miRNA的表达影响PTEN和β-catenin参与调控成骨分化过程。第四部分:实验发现在干扰Dicer基因表达的MC3T3-E1细胞中同时转染miR21 mimics或加入PTEN抑制剂VO-OHpic,均可部分逆转由于Dicer干扰引起的成骨分化抑制,提示miR-21a-5p可能通过靶向抑制PTEN参与调节成骨分化。Western-blot结果发现在成骨分化过程中Dicer,β-catenin表达升高,p-Akt和p-GSK3β磷酸化水平上调,提示在成骨分化过程中Runx2启动了Dicer表达上调,随后miR-21a-5p上调和PTEN蛋白翻译抑制,Akt和GSK3β磷酸化依次升高,胞内β-catenin堆积增多,转运入核与转录因子结合启动成骨相关基因表达。相反,当Dicer表达被干扰下调,成熟的miR-21a-5p相应减少,PTEN蛋白表达升高使PIP3减少,Akt磷酸化受到抑制,GSK3β磷酸化水平也相应下降,GSK3β与Axin/APC形成复合物,使β-catenin磷酸化程度提高后启动泛素化降解,抑制细胞成骨分化,这可能是Dicer表达干扰后抑制成骨分化的机制。结论综上所述,本课题通过体外实验发现:在成骨分化过程中,Runx2作为成骨特异性转录因子通过与Dicer启动子结合,直接调控Dicer转录表达。Dicer在细胞成骨分化中表达增高,并对细胞成骨分化起着正向调节作用。miR-21a-5p在成骨分化过程中表达增高,抑制其靶基因PTEN蛋白表达,使Akt和GSK3β磷酸化水平升高,GSK3β磷酸化后从Axin/APC复合体分离,使复合体对β-catenin的磷酸化作用失活,胞内β-catenin堆积增多,转运入核与转录因子结合共同调控成骨相关基因表达。