南柴胡“Anti-UV Clone”细胞株的组织培养及其提取物研究

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一株由传统中药南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Wilid.)茎尖诱导的细胞株,在通常紫外线致死剂量2-3倍的情况下,染色体仍然不发生片断化,进一步在大量的柴胡原生质体中利用高剂量紫外线照射筛选,获得一株在致死剂量2-3倍下仍然存活、可以正常形成细胞壁并正常分裂的细胞株,命名为“Anti-UV Clone”。本实验针对该克隆进行组织培养,筛选最适宜其生长的激素类型和浓度,并对其生长速率、褐化情况、培养基pH变化等方面展开一些基础观察研究,开展相同时相细胞材料的保种、扩大培养研究,为将来开展细胞工程应用积累了资料,并满足进一步实验研究和开发利用的需要。“Anti-UV Clone”在添加了1.0mg/L2,4-D的MS培养基(含3.0%的蔗糖和0.55%琼脂,pH=5.8)上生长状况最好,14d增殖速率达486%,质地疏松,褐化率低。液体悬浮培养中发现,接种后5d-15d细胞生长迅速,15d后基本停止生长,pH值随着培养的进程由开始的5.8降至5.0(第10d),然后又回升。   由于植物没有成熟的紫外线损伤模型,本实验利用紫外线照射体外培养的角质形成细胞株(HaCaT细胞),建立紫外线损伤模型,并用MTT检测法研究“Anti-UVClone”提取物对紫外线引起的人角质形成细胞HaCaT细胞的凋亡和死亡的影响。通过实验证实,紫外线照射可以导致细胞的凋亡和死亡,60mJ/cm2照射后细胞存活率为47.5%,以该照射剂量为细胞的半致死剂量建立了紫外线诱导的HaCaT细胞凋亡模型。   分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇提取“Anti-UV Clone”细胞株有效成分,进行细胞毒性实验及抗紫外线实验。实验表明,在不照紫外线的情况下,95%乙醇提取物对于HaCaT细胞和人肝癌细胞HepG2细胞的增殖均有促进作用,不同浓度促进效果不同,其中以2.5mg/L浓度效果最好,添加后两种细胞增殖速率分别比空白对照高出43.71%和10.52%。而其他三种溶剂的提取物都会抑制这两种细胞的增殖,浓度越大抑制作用越强,抑制率最大分别可达40.20%和45.30%。   四种不同极性溶剂的提取物都对紫外线照射的细胞损伤有保护作用,不同浓度保护效果不同。照射紫外线前加提取物和照射紫外线后加提取物,都是乙醇提取物的保护效果最好,使用浓度为3.75mg/L时保护率最大分别为37.61%和42.33%,随浓度的递减保护率也随之递减。“Anti-UV Clone”的乙醇提取物不但能促进HaCaT细胞和HepG2细胞的生长,还能够减少紫外线对HaCaT细胞造成的损伤,并对光损伤具有修复作用,因此,“Anti-UV Clone”可能在防止皮肤的光损伤和光损伤修复方面具有潜在的应用价值。   黄酮和多糖类化合物是紫外线的主要吸收物,并且还有抗炎、增强免疫力等生理功能。本实验测定“Anti-UV Clone”中总黄酮和多糖的含量分别为8.09%和2.198%。总黄酮含量明显高于普通药用南柴胡和其他品种柴胡的黄酮含量。因多糖主要存在于药用植物的地下部分,狭叶柴胡地上部分的多糖含量测定国内尚未见报道,本实验研究表明“Anti-UV Clone”中多糖含量相比其他药用植物高。“Anti-UV Clone”细胞株的抗紫外线能力是否由这两类化合物提供,还有待于对其进行进一步的分离、纯化研究。
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