论文部分内容阅读
核酶是一类具有催化功能的RNA分子，自剪切核酶是诸多功能的核酶家族中较为显著的一个分支，其中典型的为锤头型核酶(hammerhead)，发夹型核酶(hairpin)及最近发现的twister等。这些自剪切核酶在工作机制方面都依赖RNA二级、三级结构上活性构象的正确形成，并且不同种类的自剪切核酶均具备自身独特的结构形式。锤头型核酶(HHRz)作为自剪切核酶家族中尤为重要的一个成员，不仅是该分类中首个被发现的核酶，而且在后续研究工作中被证实几乎存在于所有的生物学领域，很可能是分布最广泛的一类核酶。相对简单的结构模式和作用方式使得HHRz具备了被广泛应用的巨大潜力。HHRz经典的二级结构主要由三个可变的茎环结构（stemⅠ/Ⅱ/Ⅲ和loopⅠ/Ⅱ/Ⅲ）围绕着催化核心构成，该催化核心由13个保守的必需核苷酸组成（见蓝色部分），而HHRz自剪切反应发生位点往往存在于一个核苷酸三联体GUC↓3端。HHRz在随后的研究工作中通过从loopⅢ被劈开，成为了两个独立的分子。其中剪切位点位于作为底物的部分分子内，而保守催化核心则位于另一部分被视为核酶的RNA分子内，这就使得HHRz的自剪切催化反应完成了成分子内（cis-）到分子间（trans-）的转变。反应过程中，核酶分子通过剪切位点两侧的binding arm识别识别并结合底物分子，二者因此形成分子间剪切复合体的完整形式，并得在三联体核苷酸位点后发生剪切。这种催化核心保守，同时binding arm可变的作用方式意味着，任何一段RNA序列，只要其内部包含满足识别条件的剪切位点，理论上均能通过针对性设计与之匹配的核酶序列，实现对目标RNA底物分子的剪切。目前研究表明，理想RNA底物分子内部的剪切位点核苷酸三联体需满足“NUX↓”序列规则，其中N代表任意一种核苷酸，U代表尿嘧啶核苷酸，X代表除鸟嘌呤核苷酸以外的其他三种核苷酸。也就是说，原则上所有包含满则“NUX↓”核苷酸三联体序列规则的RNA分子，均能与其对应的核酶分子发生分子间剪切。因此，数十年间HHRz被认为是研究RNA分子间剪切的理想工具模型，大量基于其分子间剪切能力的相关研究也如火如荼。迄今为止HHRz已经被应用于通过RNA剪切抑制HIV复制，并且AIDS病人基因治疗也进入了临床一期的研发，同时HHRz还被发现能通过特异性识别并剪切病毒基因组抑制HCV的感染。 围绕锤头型核酶的结构与功能研究，本论文由两部分组成，主要内容包括: 第一部分，细胞内直接进化锤头型核酶策略的构建。在利用HHRz剪切位点“NUX↓”序列规则针对目标RNA分子设计核酶序列的过程中，始终存在局限性，也就是说预期剪切位点是鸟嘌呤核苷酸时，并不能通过现有的HHRz模式完成理想剪切，这就需要有目的的对其进行进化筛选。事实上，目前为止针对HHRz的筛选工作多采用经典的体外筛选策略，但体外筛选条件并不能完全模拟细胞内复杂而多变的环境，事实上体外筛选得到的相当一部分HHRz在体内所表现出的催化效率往往差强人意。因此，针对锤头型核酶进化与功能限制方面，本文建立了一种基于毒性蛋白报告基因的体内进化筛选HHRz的方法，并以该策略为基础，进行了剪切位点为鸟嘌呤的特异性HHRz细胞内筛选，在此基础上得到剪切位点G特异性的核酶序列，以期为HHRz作为分子间RNA剪切工具提供更为广泛的应用空间。此外，通过随机库细胞内筛选分子间作用HHRz的尝试，表明了该方法在筛选HHRz或RNA方面的可行性，该策略被认为有潜力被应用于其他类似功能性RNA的细胞内筛选，并最终为基因表达调控相关研究提供依据与支持。 第二部分，锤头型核酶剪切位点序列规则研究及表征。锤头型核酶作为潜力巨大的分子工具，其模式结构不断经历概括与修正，人们先后提出了包括minimal HHRz、extended HHRz在内的数个锤头型核酶模体概念，关于其催化核心的保守位点与可变区域也在数十年间众说纷纭，目前关于HHRz剪切位点较为统一的说法是“NUX↓”序列规则。然而在利用Schistosoma mansoni HHRz进行RNA剪切实验发现了剪切位点为GUG时HHRz仍然具备催化活性这一与目前研究结论矛盾的现象。针对前人的具体相关研究进行了剪切实验的重复，并针对具体剪切结果提出并验证了假说，最终认为目前关于锤头型核酶序列规则的相关结论是不准确的。因此本文针对性地对锤头型核酶重新进行了表征，以期为后续利用锤头型核酶进行RNA剪切的相关研究提供依据与说明。